本文選題：MicroRNAs　切入點(diǎn)：橘小　出處：《華中農(nóng)業(yè)大學(xué)》2015年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：橘小實(shí)蠅是廣泛分布于東亞和太平洋地區(qū)的最重要的園藝害蟲之一。在其防治策略中,雄性不育技術(shù)(SIT)具有高特異、環(huán)境友好的巨大優(yōu)勢,然而傳統(tǒng)的SIT依賴于輻照和化學(xué)不育劑,容易損傷不育雄蟲的交配競爭力,從而限制了其防治效果。近年來,基于遺傳改造的SIT在橄欖實(shí)蠅的防治中表現(xiàn)優(yōu)異,顯示了在實(shí)蠅防治應(yīng)用中的巨大潛力。另一方面,microRNAs(miRNAs)作為一種負(fù)向調(diào)控目標(biāo)基因表達(dá)的關(guān)鍵性的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子,參與調(diào)控了各種生命過程,其中就包括對精子發(fā)生的調(diào)控。因此,基于精子發(fā)生關(guān)鍵mi RNA的遺傳改造技術(shù)對于SIT具有重要的開發(fā)價(jià)值。然而到目前為止,橘小實(shí)蠅中精子發(fā)生調(diào)控相關(guān)miRNA的研究還很缺乏。本研究首先對性成熟期(FM)、初羽化(IM)、生殖前期(MA)橘小實(shí)蠅的精巢組織small RNA進(jìn)行了深度測序,并整合構(gòu)建了總small RNA轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫,預(yù)測了172個(gè)已知和78個(gè)未知的miRNA,并分析了它們在精子發(fā)生過程中的表達(dá)動(dòng)態(tài)。然后,通過對三個(gè)發(fā)育時(shí)期精巢組織small RNA轉(zhuǎn)錄譜進(jìn)行兩兩比較,分別發(fā)現(xiàn)了在FM與IM、FM與MA、IM與MA發(fā)育時(shí)期之間差異表達(dá)的24、15、14個(gè)精巢mi RNA。通過生物信息學(xué)分析,進(jìn)一步預(yù)測了13個(gè)轉(zhuǎn)錄差異最大的miRNA的124個(gè)靶標(biāo)基因,并從中隨機(jī)選擇了6個(gè)miRNA和其預(yù)測調(diào)控的基因進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證分析,發(fā)現(xiàn)有4個(gè)miRNA與其靶標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄模式相反。進(jìn)一步的,對這4個(gè)miRNA中的mi R-8-3p調(diào)控精子發(fā)生的功能進(jìn)行了深入研究。首先,我們預(yù)測出mi R-8-3p的靶標(biāo)基因,B.dorsalis mitoferrin(bmfrn),推測miR-8-3p通過負(fù)調(diào)控bmfrn來調(diào)節(jié)精子發(fā)生。接下來,我們通過HeLa細(xì)胞的dual-luciferase報(bào)告系統(tǒng)驗(yàn)證了mi R-8-3p通過結(jié)合bmfrn的3′UTR區(qū)抑制后者的表達(dá)。而且,miR-8-3p的類似物(antagomi R)或bmfrn的dsRNA注射處理都能顯著抑制mitoferrin的轉(zhuǎn)錄,減少精子數(shù)量,降低精子活性,最終抑制了橘小實(shí)蠅雄蟲的生育能力�？傊�,本研究首次開展了不同生殖發(fā)育時(shí)期的雄性橘小實(shí)蠅精巢的miRNA轉(zhuǎn)錄組比較分析,描述了與精子發(fā)生相關(guān)的miRNA轉(zhuǎn)錄譜。同時(shí),本研究篩選出調(diào)控精子發(fā)生的mirna,即mir-8-3p,并證實(shí)其通過結(jié)合bmfrn的3'utr區(qū)來抑制后者的表達(dá),而最終影響精子發(fā)育。本研究對基于遺傳改造的sit技術(shù)具有重要的理論和實(shí)際意義。
[Abstract]:Fruit fly is one of the most important horticultural pests widely distributed in East Asia and the Pacific. However, the traditional SIT relies on irradiation and chemical sterilizers, which can easily damage the mating competitiveness of male sterile insects, thus limiting its control effect. In recent years, SIT based on genetic transformation has performed well in the control of olive-fly. On the other hand, microRNAsmiRNAsS, as a key post-transcriptional regulator of negative regulation of target gene expression, is involved in regulating various life processes. This includes regulation of spermatogenesis. Therefore, genetic modification based on the key mi RNA in spermatogenesis has important development value for SIT. The studies of spermatogenesis and regulation of spermatogenesis related miRNA in fruit fly were still lacking. In this study, the small RNA of spermatozoa tissue of the fruit fly was deeply sequenced, and the total small RNA transcriptional database was constructed. 172 known and 78 unknown miRNAs were predicted, and their expression dynamics during spermatogenesis were analyzed. Then, the small RNA transcriptional profiles of spermatozoa during three developmental stages were compared. A total of 24, 15 and 14 spermary miRNA differentially expressed between FM and IMFM and MAHIM and MA were found respectively. By bioinformatics analysis, 124 target genes of 13 miRNA with the largest transcriptional difference were further predicted. Six miRNA and its predictive regulatory genes were randomly selected for qRT-PCR validation analysis. It was found that 4 miRNA were reverse to the transcription patterns of their target genes. The regulation of spermatogenesis by miR-8-3p in these four miRNA was studied. Firstly, we predicted the target gene of miR-8-3p, B.dorsalis mitof errinine bmfrnn, and speculated that miR-8-3p regulates spermatogenesis through negative regulation of bmfrn. We confirmed by dual-luciferase reporting system of HeLa cells that miR-8-3p inhibits the expression of the latter by binding to the 3UTR region of bmfrn. Moreover, either the injection of bmfrn or dsRNA can significantly inhibit the transcription of mitoferrin, decrease the number of sperm, and decrease the activity of sperm. In conclusion, the comparative analysis of miRNA transcriptome of male spermatozoa at different reproductive stages was carried out for the first time, and the miRNA transcriptional profiles associated with spermatogenesis were described. In this study, mirna, or mir-8-3p, was selected to regulate spermatogenesis, and it was confirmed that it inhibited the expression of bmfrn by binding to the 3tutr region of sit, and ultimately affected sperm development. This study has important theoretical and practical significance for sit based on genetic modification.
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S433

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本文編號：1592609