本文關鍵詞： 十字花科黑腐病菌 小RNA 功能鑒定 過量表達 缺失　出處：《廣西大學》2015年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：細菌小RNA,也叫非編碼RNA,是一類大小處于50～500 nt之間的RNA分子。細菌小RNA可以獨立地行使一些特定的功能,但是不具備編碼蛋白的能力,與核糖體RNA和轉運RNA有明顯的差異。小RNA廣泛存在于各種生物中,對細胞的生理過程起著重要的調節(jié)作用。研究表明,它們作為轉錄后調控因子在細菌的糖代謝、碳源代謝、群體感應、應激反應、細胞運動和致病性等方面發(fā)揮著重要的調控作用。目前,小RNA的鑒定工作以及對其功能進行研究是當前微生物學研究領域的前沿和熱點。目前,有效鑒定小RNA方法已經成功建立,已經成功鑒定了近1000個細菌小RNA,但是它們的生物學功能幾乎沒有被確定。小RNA在植物病原細菌致病過程中的作用和重要性仍然需要更深入的研究。十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestris pathovar campestris,下文簡稱為Xcc)是引起十字花科植物黑腐病的病原菌,它是研究病原菌與植物相互作用領域的一個極其重要的模式菌株。近來,本課題組采用RNA深度測序(RNA-seq)方法,對Xcc 8004菌株在MMX基本培養(yǎng)基中生長至對數(shù)期時表達的小RNA進行了鑒定,結果發(fā)現(xiàn)了500多個候選。但是這些候選小RNA的生物學功能仍不清楚。本研究選取了十個候選小RNA作為研究對象,首先采用三引物RT-PCR法確證它們的存在,然后分別構建這十個候選小RNA的缺失突變體和過量表達株,然后對構建成功的缺失突變體和過量表達株的相應表型均進行檢測和分析討論從而得知它們具有怎么的生物學功能。三引物RT-PCR結果分析得知這十個候選小RNA的確是真實存在的。然后,通過鏈特異性RT-PCR的方法,我們可以進一步得知這十個小RNA的主要轉錄方向。目前,本研究已成功構建了這10個目的小RNA的9個缺失突變體和10個過量表達菌株,然后,對成功構建的所有缺失突變體和過量表達株均進行了一系列的表型檢測,分別為：(1)在豐富培養(yǎng)基和基本培養(yǎng)基內的生長情況、(2)胞外多糖產量和胞外酶活性、(3)游動性、(4)生物膜形成、(5)在非寄主植物上引起的高敏反應(HR反應)、(6)在寄主植物上的致病能力等表型進行了檢測,然后把檢測的所有表型與野生型菌株和帶有空的過量表達載體pBBad18K的野生型菌株的表型作出了相應的比較和分析。結果發(fā)現(xiàn)：(1)小RNA sRXcc-50的缺失突變體DM50在豐富培養(yǎng)基中的生長穩(wěn)定期的菌體密度小于野生型菌株；(2)小RNA sRXcc-49、sRXcc-51、sRXcc-52、sRXcc-55的缺失突變體DM49、DM51、 DM52、DM55在基本培養(yǎng)基中的對數(shù)期和穩(wěn)定期的菌體密度明顯小于野生型菌株；(3)小RNA sRXcc-53的過量表達株OE53在基本培養(yǎng)基中的對數(shù)期和穩(wěn)定期的菌體密度明顯低于對照組WT/pBBad18K;(4)小RNA sRXcc-55的過量表達株OE55在基本培養(yǎng)基中的對數(shù)期和穩(wěn)定期的菌體密度明顯高于對照組WT/pBBad18K;(5)小RNA sRXcc-49的缺失突變體DM49在辣椒葉片上出現(xiàn)HR反應的時間比野生型Xcc 8004早；(6)小RNA sRXcc-52、sRXCC-55、sRXCC-56的過量表達株OE 52、OE 55、ROE56在辣椒葉片上出現(xiàn)HR反應的時間比對照組WT/pBBad18K早；(7)其它的缺失突變體和過量表達株的所有表型檢測結果幾乎與對照菌株的完全一樣。檢測結果表明：(1)小RNA sRXCC-49、sRXCC-50、sRXCC-51、sRXCC-52、 sRXCC-53、sRXCC-55與Xcc的生長有關；(2)小RNA sRXCC-49、sRXCC-52、 sRXCC-55、sRXCC-56在Xcc8004的過敏反應中可能起著重要的調控作用。綜上所述,本工作驗證了十個Xcc候選小RNA的存在,確定了它們的轉錄方向,并對它們的生物學功能進行了鑒定。結果發(fā)現(xiàn)了六個小RNA (sRXCC-49、sRXCC-50、sRXCC-51、sRXCC-52、sRXCC-53、sRXCC-55)與生長有關,四個(sRXCC-49、sRXCC-52、sRXCC-55、sRXCC-56)與HR反應有關。這些結果增加了人們在小RNA功能研究領域的知識,為深入探討小RNA在Xcc中的具有怎樣的功能以及如何參與機理調控提供了重要的素材。
[Abstract]:Bacterial small RNA, also called non RNA encoding, is a kind of size in the RNA molecule 50~500 NT. Bacterial small RNA can independently exercise some specific function, but does not have the ability of encoding protein, there are obvious differences between the ribosomal RNA and transfer RNA. RNA exists widely in all kinds of biological, physiological the process of cells play an important role. The research results show that as the post transcriptional regulation factor in the sugar metabolism of bacteria, carbon metabolism, quorum sensing, stress response, play an important role in cell motility and pathogenicity. At present, identification of small RNA and the function of the frontier and hot point in the research field of microbiology. At present, the effective identification of small RNA method has been successfully established, has successfully identified nearly 1000 small bacteria RNA, but their biological functions have hardly been determined. Small RNA in plants The role and importance of complex pathogenic bacteria in the pathogenic process still need further research. XpsE (Xanthomonas campestris pathovar campestris, hereinafter referred to as Xcc) is the pathogen of crucifers black rot, it is a very important research field of pattern strains of pathogenic bacteria and plant interactions. Recently, our research group used RNA deep sequencing (RNA-seq) method of Xcc 8004 strain in MMX medium and grown to logarithmic phase when the expression of RNA was identified and found more than 500 candidate. But the biological function of these candidate RNA remains unclear. This study selected ten candidate small RNA as the research object, firstly using three primer RT-PCR method confirmed their existence, then construct the deletion mutants of the ten candidate RNA and overexpression strains, and to build a successful. The corresponding phenotype loss mutants and overexpressing strains were detected and analyzed so as to know how they have biological function. Three primer RT-PCR results of the ten candidate RNA is indeed real. Then, through the method of chain specific RT-PCR, we can further learn the main transcription direction of the ten small RNA at present, this study has successfully constructed 9 deletion mutants of the 10 to 10 small RNA and overexpression strains, then, were all constructed deletion mutants and overexpression strains were phenotypic assays, a series of: (1) in rich medium and medium growth the situation of the media, (2) extracellular polysaccharide production and intracellular enzyme activity (3), motility, biofilm formation (4), (5) Gao Min reaction due to non host plants on (HR reaction), (6) in the host plant pathogenic ability The phenotype was detected, then the phenotype of wild type strains and wild type strains of all phenotypic detection and with empty excess expression vector of pBBad18K has made the comparison and analysis of the corresponding. Results showed that: (1) RNA sRXcc-50 deletion mutant DM50 in rich growth stable cell density in the medium is smaller than the wild strain; (2) RNA sRXcc-49, sRXcc-51, sRXcc-52, sRXcc-55 deletion mutant of DM49, DM51, DM52, DM55 in basic medium in the log phase and stable phase of cell density was significantly less than that of wild type strain; (3) overexpression of sRXcc-53 small RNA strains of OE53 in basic medium in logarithmic phase and the stable cell density was significantly lower than the control group (WT/pBBad18K; 4) overexpression of small RNA sRXcc-55 strains of OE55 in basic medium in the log phase and stable phase of cell density was significantly higher than the control group (WT/pBBad18K; 5) DM49 small RNA sRXcc-49 deletion mutant HR reaction in pepper leaves on time earlier than the wild type Xcc 8004; (6) RNA sRXcc-52, sRXCC-55, sRXCC-56 overexpression strains OE 52, OE 55, ROE56 HR reaction in pepper leaves on time than the control group WT/pBBad18K; (7) all phenotype the detection results of deletion mutants and overexpression strains and other strains were almost the same. The detection results show that: (1) RNA sRXCC-49, sRXCC-50, sRXCC-51, sRXCC-52, sRXCC-53, sRXCC-55 and Xcc growth; (2) RNA sRXCC-49, sRXCC-52, sRXCC-55, sRXCC-56 may play an important role in regulation the allergic reaction in the Xcc8004. In summary, this work verified the ten Xcc candidate RNA, to determine the direction of transcription of them, and their biological functions were identified. Results showed that six small RNA (sRXCC-49, s RXCC-50, sRXCC-51, sRXCC-52, sRXCC-53, sRXCC-55) and growth, four (sRXCC-49, sRXCC-52, sRXCC-55, sRXCC-56) associated with the HR reaction. These results increase people's knowledge in the field of function of small RNA, for the in-depth study of RNA function in Xcc is how and how to participate in the regulation mechanism provides important material.

【學位授予單位】：廣西大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S432.4

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本文編號：1555480