本文關(guān)鍵詞： 截形葉螨 微衛(wèi)星 COI 種群遺傳多樣性 種群遺傳結(jié)構(gòu) Wolbachia RFLP 微衛(wèi)星轉(zhuǎn)移性 多重PCR　出處：《南京農(nóng)業(yè)大學(xué)》2015年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：截形葉螨Tetranychus truncatus(Ehara)屬于蛛形綱Arachnida、蜱螨亞綱Acari、真螨目Acariformes、葉螨科Tetranychidae,是一種多食性的重要害螨,是東亞和東南亞地區(qū)的主要農(nóng)作物和經(jīng)濟作物害蟲之一。和絕大多數(shù)葉螨屬螨類類似,截形葉螨主要通過刺吸式口器取食危害寄主。當(dāng)取食時,其口針刺入葉片組織,取食柵欄層細(xì)胞的葉綠粒和細(xì)胞液而對植物造成危害。棉苗等作物受害時整個葉片變黃發(fā)皺直至干枯脫落。截形葉螨的近似種二斑葉螨是葉螨屬中被研究最多的害螨,其基因組也于2011年底發(fā)表。而實驗室近五年采樣調(diào)查發(fā)現(xiàn),中國主要棉區(qū)、玉米產(chǎn)區(qū)等地截形葉螨有替代二斑葉螨成為主要害螨的趨勢。然而,由于遺傳標(biāo)記的缺乏,中國截形葉螨的種群遺傳結(jié)構(gòu)及種群遺傳多樣性尚未進(jìn)行系統(tǒng)的研究。Wolbachia是一種胞內(nèi)共生菌,其廣泛存在于節(jié)肢動物體內(nèi),同線粒體一樣也是母系遺傳。Wolbachia通過誘導(dǎo)產(chǎn)生胞質(zhì)不親和(cytoplasmic incompatibility,CI)、雌性化(feminization)、孤雌生殖(parthenogenesis)和殺雄作用(male-killing)四種方式調(diào)控寄主的生殖行為,以實現(xiàn)其在寄主種群中的穩(wěn)定存在和擴散。由于Wolbachia對于寄主的生殖調(diào)控和復(fù)雜的生物學(xué)影響,很多學(xué)者研究認(rèn)為Wolbachia能夠影響宿主種群遺傳結(jié)構(gòu)及遺傳多樣性,甚至能產(chǎn)生生殖隔離促進(jìn)物種形成。Wolbachia在葉螨體內(nèi)存在的報道已經(jīng)不少,但其對于葉螨種群分化及遺傳結(jié)構(gòu)的影響尚不清楚。基于以上原因,本研究主要利用微衛(wèi)星和線粒體COI分子標(biāo)記來研究截形葉螨的遺傳多樣性,遺傳結(jié)構(gòu),遺傳分化與地理距離、溫度和內(nèi)共生菌Wolbachia之間的聯(lián)系。由于本實驗之前可應(yīng)用的截形葉螨微衛(wèi)星位點較少,本研究首先利用形態(tài)與分子相結(jié)合的方法區(qū)分截形葉螨與二斑葉螨、豆葉瞞、盧氏葉螨、皮氏葉螨等易混淆種,準(zhǔn)確鑒定截形葉螨,接著利用微衛(wèi)星的轉(zhuǎn)移特性,從二斑葉螨基因組中通過生物信息學(xué)方法篩選微衛(wèi)星并轉(zhuǎn)移到截形葉螨中試驗,開發(fā)截形葉螨的微衛(wèi)星標(biāo)記。接著研究出一種高效穩(wěn)定的分型方法用于高通量微衛(wèi)星分型,并在神澤葉螨、花薊馬、褐飛虱中驗證分型方法的可靠性和通用性。最后利用上述開發(fā)的微衛(wèi)星及其高通量分型方法外加線粒體COI分子標(biāo)記來研究截形葉螨的遺傳多樣性,遺傳分化,種群遺傳結(jié)構(gòu)等。之前有學(xué)者研究表明,GenBank中至少30%的葉螨序列鑒定錯誤,使得單純依靠分子測序鑒定葉螨并不可靠。同時,葉螨屬截形葉螨同二斑葉螨紅色型、豆葉螨、盧氏葉螨等形態(tài)十分相似,形態(tài)學(xué)鑒定需要很扎實的功底且不適合于種群研究中高通量的葉螨鑒定。本研究使用形態(tài)與分子相結(jié)合的方法,形態(tài)學(xué)上以雄螨陽具為依據(jù),分子鑒定依據(jù)核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性技術(shù)(RFLP)圖譜鑒定。兩者結(jié)合準(zhǔn)確鑒定截形葉螨等常見的葉螨種,為后續(xù)針對截形葉螨的研究打下堅實基礎(chǔ)。通過本方法還有效鑒定了二斑葉螨,其基因組是微衛(wèi)星轉(zhuǎn)移法開發(fā)的重要資源。鑒定出的神澤葉螨則為驗證高通量微衛(wèi)星分型方法提供了材料。由于傳統(tǒng)開發(fā)微衛(wèi)星標(biāo)記的方法成本昂貴且耗時,導(dǎo)致大部分非模式生物微衛(wèi)星位點極少甚至無位點可用。微衛(wèi)星標(biāo)記的缺乏大大阻礙了對截形葉螨種群遺傳結(jié)構(gòu)及相關(guān)研究的開展。早先的研究表明,葉螨屬內(nèi)種間存在較高的微衛(wèi)星轉(zhuǎn)移性。進(jìn)而在本研究中,我們通過生物信息學(xué)的方法,從截形葉螨的近似種二斑葉螨的基因組序列中篩選出205個候選微衛(wèi)星位點,并進(jìn)行PCR擴增引物設(shè)計和位點測試。結(jié)果顯示近一半的(102個)引物對擴增獲得了所需的PCR產(chǎn)物,最后成功獲得36個有多態(tài)性的位點。36個位點中,每個位點包含2-23個不等的等位基因數(shù),多態(tài)信息含量PIC(polymorphism information content)為0.589(介于0.119-0.922之間)。用所獲得的36個位點對三個截形葉螨種群進(jìn)行實驗,表觀雜合度范圍為0.063-0.844,預(yù)期雜合度的范圍為0.061-0.903。通過所有種群和位點計算的總體Fst值為0.098(P0.001),表明種群間存在中等且顯著的遺傳分化。我們繼續(xù)將獲得的微衛(wèi)星位點轉(zhuǎn)移,在36個微衛(wèi)星位點中,有22個位點在皮氏葉螨T.piercei上適用,但只有小部分位點能在盧氏葉螨T.ludeni和豆葉螨T.phaselus上適用。利用轉(zhuǎn)移性對微衛(wèi)星標(biāo)記的開發(fā)頗具成本效益,對促進(jìn)種群遺傳研究有極大的意義。由于本研究所用蟲體樣本數(shù)和微衛(wèi)星位點數(shù)都較高,使用常規(guī)分型方法即熒光直接標(biāo)記微衛(wèi)星引物的方法成本過于昂貴。購買大量熒光引物的高昂成本和大批量重復(fù)的PCR擴增分型操作成為實際應(yīng)用中最主要的限制條件。繼而本研究為解決高通量微衛(wèi)星分型的問題,在前人三引物分型系統(tǒng)的基礎(chǔ)上,提出使用四種新的通用熒光引物,再利用多重PCR進(jìn)行微衛(wèi)星的分型。對于每一個位點的PCR體系包含:一條改造過的上游引物(5'端連有通用引物序列)、一條普通的下游引物和一段通用熒光引物。我們通過拓展三引物系統(tǒng),運用分別帶有四種不同顏色熒光的四條不同通用引物,達(dá)到在一輪PCR中對8個、12個甚至更多位點進(jìn)行基因分型的目的。只需要訂購一批次的熒光引物,即可對任意位點進(jìn)行分型,這大大提高了熒光引物的使用效率。這一分型方法在截形葉螨的徐州種群(XZ)中進(jìn)行了檢驗,并為了驗證其通用性,此方法還在神澤葉螨、花薊馬和褐飛虱中進(jìn)行了驗證。與傳統(tǒng)的分型結(jié)果相比,新分型方法得到的結(jié)果信號強度普遍有所減弱,但仍完全可以清晰識別等位基因,且其片段長度與傳統(tǒng)分型方法保持一致。本研究最后通過自行開發(fā)的16個微衛(wèi)星位點和線粒體COI基因序列,對中國22個截形葉螨種群共計1159個樣本進(jìn)行了種群遺傳結(jié)構(gòu)的研究。分析發(fā)現(xiàn)相較于其他葉螨,我國的截形葉螨除JQ和JMN種群外多樣性較高,種群間分化較大(平均FST=0.21,P0.001)。使用貝葉斯聚類,我們將中國的截形葉螨種群分為兩個大的分支,且兩個分支組分隨著溫度帶的變化而有規(guī)律的變化。由于有較強的IBD效應(yīng),我們認(rèn)為氣候條件和地理隔離是引起截形葉螨種群核基因遺傳分化的主要因素�；贑OI基因的統(tǒng)計顯示共含有19個單倍型,除JMN、JQ和XZZ三個種群只有一種單倍型外,其余種群單倍型和核酸多樣性較好。Wolbachia感染率從最低的2.82%(ZJ)至最高的80.39%(BTB)不等。檢測wsp基因共發(fā)現(xiàn)11種序列型分屬于Ori和Con兩種株系。Ori株系是廣泛存在于各種群的(除了 JMN),Con株系則局限于JMN、ZZ、BTB和BTC種群。超感染現(xiàn)象主要存在與BTB和BTC種群。Wolbachia雖然與單倍型沒有明顯的一一對應(yīng)關(guān)系,但對于COI的分化起到顯著作用。對中國22個截形葉螨地理種群的遺傳結(jié)構(gòu)及寄生菌Wolbachia的感染情況進(jìn)行綜合分析,可以得出結(jié)論截形葉螨種群核基因分化水平與地理距離呈正相關(guān),且與氣候帶分布關(guān)系密切,而與Wolbachia無關(guān)。研究結(jié)果有助于深入了解截形葉螨暴發(fā)的機理和種群高度分化的原因,并為截形葉螨防治工作提供理論依據(jù)。
[Abstract]:Acari , Acari , Acari , Acari , Acari , Acari , Acari , Acari , Acari , Acari , Tetranychidae , is one of the main pest mites in East Asia and Southeast Asia . In this study , we identified 205 candidate microsatellite loci from the genomic sequences of nearly two species of spider mites , which were identified by restriction endonuclease fragment length polymorphism ( RFLP ) . The results showed that the total Fst value was 0.098 ( P0.001 ) , and the number of polymorphic information was 0.061 - 0.903 . P0.001). In this paper , we have found that there are 19 single - fold types of spider mites in China . The results show that there are 19 single - fold types except JMN , JQ and XJ .

【學(xué)位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S433.7

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