本文關(guān)鍵詞： 蝶蛹金小蜂 毒液 絲氨酸蛋白酶抑制劑 基因克隆 表達(dá)模式　出處：《浙江大學(xué)》2015年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：寄生蜂是重要的農(nóng)業(yè)害蟲天敵,在生物防治中發(fā)揮著相當(dāng)重要的作用,寄生蜂在產(chǎn)卵過程中,伴隨有將毒液、多分DNA病毒、類病毒顆粒等寄生因子一并注入寄主體內(nèi),通過調(diào)控寄主免疫反應(yīng)和寄主的生長發(fā)育,以確保其后代能夠在寄主體內(nèi)正常發(fā)育。蝶蛹金小蜂(Pteromalus puparum)是十字花科蔬菜害蟲菜粉蝶蛹期優(yōu)勢內(nèi)寄生蜂,其僅含有毒液一種寄生因子。目前對(duì)蝶蛹金小蜂毒液蛋白已經(jīng)鑒定明確60個(gè)蛋白組分,并分為蛋白酶類、蛋白酶抑制劑、識(shí)別或結(jié)合蛋白、其他及功能未知蛋白五大類(王磊,2012),本論文主要研究蝶蛹金小蜂絲氨酸蛋白酶抑制劑PpSPN4和PpSPN6的基因克隆與表達(dá)模式。1.蝶蛹金小蜂絲氨酸蛋白酶抑制劑PpSPN4的基因克隆與表達(dá)模式分析 通過3’和5’RACE克隆得到蝶蛹金小蜂的PpSPN4的cDNA全長。PpSPN4的cDNA序列全長2623bp,開放式閱讀框(ORF)長1923bp,共編碼641個(gè)氨基酸,預(yù)測分子量為72.3kDa,通過SignalP分析,前23個(gè)氨基酸為信號(hào)肽。將去信號(hào)肽的PpSPN4的氨基酸全序列與其他物種中的serpin序列進(jìn)行同源性比較,構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,結(jié)果表明,PpSPN4和麗蠅蛹集金小蜂(Nasonia vitripennis)的serpin4(XM_001603896.2)相似性最高。構(gòu)建的原核表達(dá)載體pET28a-PpSPN4并在自動(dòng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基的誘導(dǎo)下進(jìn)行表達(dá),SDS-PAGE結(jié)果顯示pET28a-PpSPN4能在大腸桿菌中大量表達(dá)。通過對(duì)PpSPN4在蝶蛹金小蜂頭、胸、腹(不包括毒囊毒腺和卵巢)、卵巢、毒囊毒腺各組織中的表達(dá)情況進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR與Western blot分析,明確該基因在毒囊毒腺中高表達(dá)。對(duì)蝶蛹金小蜂雌蜂毒液絲氨酸蛋白酶抑制劑PpSPN4進(jìn)行時(shí)間表達(dá)分布分析。Western blot結(jié)果表明PpSPN4在不同時(shí)期毒液中都有表達(dá),在羽化后6天內(nèi),蛋白含量出現(xiàn)了兩個(gè)高峰期,分別為羽化后第4天與羽化后第6天；定量PCR結(jié)果表明,該基因在羽化第1天和羽化后第5天分別出現(xiàn)兩次轉(zhuǎn)錄高峰期。 2.蝶蛹金小蜂絲氨酸蛋白酶抑制劑PpSPN6的基因克隆與表達(dá)模式分析 結(jié)合RACE技術(shù)與本地BLAST分析,克隆獲得蝶蛹金小蜂的PpSPN6的cDNA全長。PpSPN6的cDNA全長1806bp,ORF長1197bp,共編碼399個(gè)氨基酸,前19個(gè)氨基酸為信號(hào)肽,預(yù)測分子量為44.1kDa。將去信號(hào)肽的PpSPN6的氨基酸全序列與其他物種中的serpin序列進(jìn)行同源性比較,構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,分析知PpSPN6和麗蠅蛹集金小蜂的serpin3/4(XP_008201843.1)、alaserpin (XP_008201838.1)相似性最高。構(gòu)建的原核表達(dá)載體pET28a-PpSPN6并在自動(dòng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基的誘導(dǎo)下,SDS-PAGE結(jié)果顯示pET28a-PpSPN6能在大腸桿菌中大量表達(dá)。對(duì)蝶蛹金小蜂雌蜂頭、胸、腹(不包括毒囊毒腺和卵巢)、卵巢、毒囊毒腺各組織中該基因的表達(dá)情況進(jìn)行半定量PCR和Western blot分析,基因PpSPN6雌蜂毒囊毒腺中高表達(dá)。利用Western blot和半定量PCR對(duì)PpSPN6在不同時(shí)期蝶蛹金小蜂雌蜂毒液中的表達(dá)與轉(zhuǎn)錄情況進(jìn)行分析,結(jié)果表明,PpSPN6表達(dá)量在羽化后前4天保持遞增,在第5天表達(dá)量減少,到羽化后第6天蛋白表達(dá)量再次增加；PpSPN6基因在雌蜂羽化后0-6天均保持較高的轉(zhuǎn)錄水平,該蛋白在羽化后第2天、第3天、第5天和第6天出現(xiàn)了相對(duì)較高的表達(dá)水平。
[Abstract]:This paper mainly studies the gene cloning and expression pattern of the serine protease inhibitor PpSPN4 and PpSPN6 . The cDNA sequence of PpSPN4 was 2623bp , the length of open reading frame ( ORF ) was 1923bp . 2 . Cloning and Expression Pattern Analysis of PpSPN6 from the Serine Protease Inhibitor of the Butterfly Pupa The expression of PpSPN6 was 1806bp . The results showed that the expression of PpSPN6 was 1806bp . The expression of PpSPN6 and serpin 3 / 4 ( XP _ 8201843.1 ) and ppSPN6 were analyzed by Western blot and Western blot . The expression of PpSPN6 was higher than that in other species .

【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S476.3

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1508048