本文關(guān)鍵詞：外源表皮降解蛋白酶基因（Cdep1）轉(zhuǎn)化蠟蚧菌及其酶活性增強(qiáng)效果評價

  更多相關(guān)文章： 蠟蚧菌 蛋白酶基因 遺傳轉(zhuǎn)化 拷貝數(shù)檢測 蟲生真菌 生物防治

【摘要】：蠟蚧菌是一種重要的蟲生真菌,對于溫室害蟲具有良好的防治效果,但是由于其作用過程慢、效果容易受環(huán)境的影響,所以在實(shí)際應(yīng)用中受到很大的限制。在蠟蚧菌侵染害蟲的過程中,其分泌的蛋白酶、幾丁質(zhì)酶等胞外酶具有重要作用。研究發(fā)現(xiàn),增加生防真菌胞外酶的分泌,能顯著地提高真菌的毒力水平。本研究從白僵菌中克隆得到一個蛋白酶基因,將其導(dǎo)入蠟蚧菌中,提高蠟蚧菌的蛋白酶分泌水平,以此改良蠟蚧菌菌株。主要研究結(jié)果如下:1.克隆外源蛋白酶基因。從一株性狀優(yōu)良的球孢白僵菌中克隆蛋白酶基因Cdep1,根據(jù)GenBank中已有的白僵菌蛋白酶基因設(shè)計引物,同源克隆得到了白僵菌的蛋白酶基因Cdep1。經(jīng)Blast比對,其與白僵菌蛋白酶基因(HQ840791)的序列同源性為99%。其對應(yīng)的氨基酸序列與堿性絲氨酸蛋白酶(KGQ12177)的同源性為99%,其中第128位的氨基酸由絲氨酸突變?yōu)槔野彼?239位氨基酸由纈氨酸突變?yōu)楸彼帷?.構(gòu)建了Cdep1蛋白酶的真菌表達(dá)載體。以質(zhì)粒pAN7-1為模板,分別克隆得到啟動子GdpA、終止子TrpC。采用重疊PCR的方法,結(jié)合降落PCR,構(gòu)建片段GdpA-Cdep1-TrpC(4021bp)。質(zhì)粒pBht2和連接片段經(jīng)過Kpn I和HindIII酶切后,使用T4連接酶將該片段與真菌表達(dá)質(zhì)粒pBht2連接,構(gòu)建了其表達(dá)的重組質(zhì)粒。3.應(yīng)用了農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法和原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化蠟蚧菌。使用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài),陽性農(nóng)桿菌在與蠟蚧菌分生孢子共培養(yǎng)2天后轉(zhuǎn)接到抗性平板中,培養(yǎng)至可見單菌落進(jìn)行驗證,結(jié)果獲得大量的轉(zhuǎn)化子,隨機(jī)挑選100個轉(zhuǎn)化子做進(jìn)一步的鑒定。對蠟蚧菌的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的條件進(jìn)行了優(yōu)化,結(jié)果表明蠟蚧菌孢子以1.5×108的濃度接種到土豆液體培養(yǎng)基中,培養(yǎng)24小時,按照1:40的比例加入復(fù)配的30mg/mL的裂解液(溶菌酶:纖維素酶:蝸牛酶=2:1:1),酶解3小時,蠟蚧菌的原生質(zhì)體數(shù)量可以達(dá)到1.8×107個/g。4.轉(zhuǎn)化子拷貝數(shù)鑒定。根據(jù)已報道的單拷貝基因EF1α設(shè)計擴(kuò)增內(nèi)參引物,采用Beacon Designer設(shè)計目的基因引物AM-3,使用熒光定量PCR技術(shù),對28個轉(zhuǎn)化子進(jìn)行拷貝數(shù)檢測。在消除擴(kuò)增效率和擴(kuò)增片段大小的差異后,結(jié)果顯示轉(zhuǎn)化子中單拷貝的有9株,兩拷貝和三拷貝的各有1株。保留單拷貝的菌株用于酶活性評價。5.轉(zhuǎn)化子酶生物活力評價。使用紫外分光光度計,通過對蛋白酶水解酪素產(chǎn)生的酪氨酸含量的測定,檢測陽性菌株的蛋白酶活力,結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)化子酶活性最高比出發(fā)菌株提高了10倍,具有進(jìn)一步研究的價值。
【關(guān)鍵詞】：蠟蚧菌 蛋白酶基因 遺傳轉(zhuǎn)化 拷貝數(shù)檢測 蟲生真菌 生物防治
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S476.12
【目錄】：

• 摘要6-7
• Abstract7-14
• 第一章 引言14-23
• 1.1 蠟蚧菌的侵染過程及其生物防治作用14-18
• 1.1.1 蠟蚧菌致病過程14-15
• 1.1.2 影響蠟蚧菌毒力的主要因子15-17
• 1.1.3 蠟蚧菌在害蟲防治中的應(yīng)用17-18
• 1.2 蠟蚧菌的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)18-21
• 1.2.1 遺傳轉(zhuǎn)化方法18-19
• 1.2.2 毒力相關(guān)基因改良19-20
• 1.2.3 Cdep1蛋白酶基因20
• 1.2.4 轉(zhuǎn)化菌株拷貝數(shù)鑒定20-21
• 1.3 研究目的、內(nèi)容及技術(shù)路線21-23
• 1.3.1 研究目的21
• 1.3.2 研究內(nèi)容21
• 1.3.3 技術(shù)路線21-23
• 第二章 目的基因基因克隆23-33
• 2.1 實(shí)驗材料23-24
• 2.1.1 供試菌株及質(zhì)粒23
• 2.1.2 主要試劑23
• 2.1.3 常用培養(yǎng)基23
• 2.1.4 常用試劑配制23
• 2.1.5 實(shí)驗儀器23
• 2.1.6 引物23-24
• 2.2 試驗方法24-26
• 2.2.1 菌株DNA提取24
• 2.2.2 菌株ITS鑒定24-25
• 2.2.3 白僵菌RNA提取25
• 2.2.4 cDNA第一鏈的合成25
• 2.2.5 白僵菌蛋白酶基因克隆25-26
• 2.2.6 pAN7-1 質(zhì)粒啟動子、終止子克隆26
• 2.3 結(jié)果與分析26-32
• 2.3.1 菌株鑒定26-27
• 2.3.2 白僵菌總RNA提取與目的基因獲得27-31
• 2.3.3 啟動子、終止子基因克隆31-32
• 2.4 討論32-33
• 第三章 表達(dá)載體構(gòu)建以及蠟蚧菌的轉(zhuǎn)化33-45
• 3.1 實(shí)驗材料33-34
• 3.1.1 供試菌株及質(zhì)粒33
• 3.1.2 主要試劑33
• 3.1.3 主要培養(yǎng)基33
• 3.1.4 實(shí)驗儀器33-34
• 3.1.5 引物34
• 3.2 實(shí)驗方法34-39
• 3.2.1 表達(dá)載體構(gòu)建示意圖34
• 3.2.2 目的基因引物設(shè)計34-35
• 3.2.3 目的基因的連接35
• 3.2.4 構(gòu)建重組質(zhì)粒35-36
• 3.2.5 重組質(zhì)粒的雙酶切驗證36
• 3.2.6 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化36-37
• 3.2.7 原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化37-39
• 3.3 結(jié)果與分析39-44
• 3.3.1 目的片段的連接39
• 3.3.2 重組質(zhì)粒雙酶切鑒定39-40
• 3.3.3 蠟蚧菌菌株鑒定40
• 3.3.4 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化鑒定40-41
• 3.3.5 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化蠟蚧菌41
• 3.3.6 原生質(zhì)體制備41-42
• 3.3.7 裂解酶種類對原生質(zhì)體影響42
• 3.3.8 菌絲培養(yǎng)時間對原生質(zhì)體的影響42-43
• 3.3.9 酶解時間對原生質(zhì)體影響43-44
• 3.4 討論44-45
• 第四章 轉(zhuǎn)化菌株及菌株酶活性變化評價45-54
• 4.1 實(shí)驗材料45-46
• 4.1.1 供試菌株45
• 4.1.2 主要試劑45
• 4.1.3 主要儀器45
• 4.1.4 培養(yǎng)基及主要試劑配制45
• 4.1.5 引物45-46
• 4.2 試驗方法46-47
• 4.2.1 假定轉(zhuǎn)化子單孢分離46
• 4.2.2 轉(zhuǎn)化子DNA驗證46
• 4.2.3 遺傳穩(wěn)定性驗證46-47
• 4.2.4 轉(zhuǎn)化子拷貝數(shù)測定47
• 4.2.5 轉(zhuǎn)化子RNA驗證47
• 4.2.6 酶活力測定47
• 4.3 結(jié)果與分析47-53
• 4.3.1 轉(zhuǎn)化子DNA驗證47-48
• 4.3.2 轉(zhuǎn)化子遺傳穩(wěn)定性檢測48
• 4.3.3 目的基因擴(kuò)增引物選擇48-50
• 4.3.4 轉(zhuǎn)化子拷貝數(shù)檢測50-51
• 4.3.5 轉(zhuǎn)化子RNA檢測51-52
• 4.3.6 轉(zhuǎn)化子酶活力比較52-53
• 4.4 討論53-54
• 第五章 結(jié)論與討論54-56
• 5.1 全文結(jié)論54
• 5.2 討論54-55
• 5.3 創(chuàng)新點(diǎn)55-56
• 參考文獻(xiàn)56-63
• 致謝63-64
• 作者簡介64

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 董汪洋;王鄭隆;楊云喬;夏麗麗;王璐;張東旭;柯樂芹;肖建中;;杏鮑菇的菌株篩選與原生質(zhì)體制備條件優(yōu)化[J];浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報;2015年05期

2 方衛(wèi)國,張永軍,馬金成,肖月華,楊星勇,裴炎;用YADE法克隆球孢白僵菌類枯草桿菌蛋白酶基因CDEP-1的啟動子及啟動子序列分析[J];菌物系統(tǒng);2003年02期

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本文編號：1024042