本文關(guān)鍵詞：嗜酸氧化亞鐵硫桿菌的培養(yǎng)特性和浸磷效果，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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氧化亞鐵硫桿菌的分離及生物學(xué)特性研究
作者姓名：馮雷 專業(yè)：生物工程 指導(dǎo)老師：謝鴻觀

摘要
氧化亞鐵硫桿菌(Thiobacillus ferrooxidans,簡稱 T. f)屬革蘭氏陰性無機(jī)化能 自養(yǎng)菌、嗜酸、專性好氧,靠氧化基質(zhì)中的 Fe2 +為 Fe3+和低價(jià)態(tài)硫?yàn)榱蛩岣@ 取能量。它

廣泛存在于土壤海水、淡水、垃圾、硫磺泉和沉積硫內(nèi),尤以金屬硫 化礦和煤礦等酸性礦坑水中最為常見。因此，本論文從 T.f 菌的分離純化出發(fā)， 進(jìn)行了 T. f 菌的生理生化及其生物活性的研究。 本文從浸礦溶液中分離得到的氧化亞鐵硫桿菌進(jìn)行研究， 結(jié)果表明硫酸亞鐵 相對(duì)于硫來說是一種速效能源，單質(zhì)硫是長效能源，并且能提供比亞鐵更高的能 量。 關(guān)鍵詞：氧化亞鐵硫桿菌，微生物冶金，生物浸礦，分離純化

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Isolation of Thiobacillus and biological characteristics
Name: Feng Lei Major: Bioengineering Supervisor: Xie Hongguan

Abstract
Ferrooxidans (Thiobacillus ferrooxidans, called T. f) ,an inorganic chemoautotroph Gram negative bacteria, acidophilus, specific aerobic, relying on substrate oxidation in Fe3+ and Fe2+ for the low state of sulfur to sulfuric acid roots and obtain energy， which is widely found in soil water, fresh water, waste, and deposition of sulfur in sulfur springs, especially in sulfide minerals such as acid mine water and coal the most common . Therefore, this paper from the T.f purification and identification of

bacteria in conducting the physiological strain Af its biological activity. This separation from the leaching solution obtained ferrooxidans study results show that compared with ferrous sulfate sulfur is a kind of quick energy, sulfur is a long-lasting energy, and can provide more energy than the ferrous . Key words: Thiobacillus ferrooxidans , microbioleaehin ,Biological leaching ,isolation

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目

錄

摘要..................................... I Abstract................................ II 一、 前 言............................ 1

1.1 生物冶金的概念 ............................................................................................................................ 1 1.2 碲礦的生物冶金 ........................................................................................................................... 2 1.3 氧化亞鐵硫桿菌的作用 ................................................................................................................ 3 1.4 本實(shí)驗(yàn)研究內(nèi)容 ........................................................................................................................... 4

二、實(shí)驗(yàn)部分............................. 5
2.1 實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備 ............................................................................................................................ 5 2.1.1 菌種采集 ................................................................................................................................. 5 2.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 ................................................................................................................................. 5 2.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 ................................................................................................................................. 5 2.1.4 培養(yǎng)基..................................................................................................................................... 6 2.2 研究方法 ........................................................................................................................................ 7 2.2.1 菌種富集培養(yǎng) ......................................................................................................................... 7 2.2.2 分離純化 ................................................................................................................................. 7 2.2.3 單層平板的制作 ..................................................................................................................... 8 2.2.4 雙層平板的制作 ..................................................................................................................... 9 2.2.5 革蘭氏染色 ............................................................................................................................. 9 2.2.6 pH 測(cè)定 ................................................................................................................................ 9 2.2.7 細(xì)菌計(jì)數(shù)方法 ......................................................................................................................... 9 2.4 生物特性研究 .............................................................................................................................. 11 2.4.1 生長曲線 ............................................................................................................................... 11 2.4.2 氧化亞鐵硫桿菌菌株對(duì)能源的利用情況 ........................................................................... 11 2.4.3 最適生長溫度的測(cè)定 ........................................................................................................... 11 2.4.4 最適初始 pH 值的測(cè)定 ........................................................................................................ 11

結(jié)果與討論.............................. 12 結(jié)論.................................... 15 致謝.................................... 16 參考文獻(xiàn)................................ 17
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一、

前 言

礦物質(zhì)是在工業(yè)生產(chǎn)中不可缺少的物質(zhì)，是經(jīng)濟(jì)建設(shè)的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。我國 含有的礦產(chǎn)資源種類豐富，礦產(chǎn)已探明儲(chǔ)量豐富。我國是一個(gè)地大物博的強(qiáng)大國 家，但由于人口基數(shù)大，導(dǎo)至各種資源人均占有量低于世界平均水平。所以我國 礦產(chǎn)資源相對(duì)緊缺，富礦多數(shù)已開發(fā)利用，還有很多貧瘠礦，礦含量相對(duì)低于其 它富礦，開采難度大�，F(xiàn)有開采技術(shù)的開采方式對(duì)環(huán)境的破壞程度大，提取礦物 質(zhì)也不完全正確，很多礦仍不能開采。針對(duì)目前的情況，微生物浸礦是一種新的 開采方式，具有溶礦率高，不污染環(huán)境等獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。

1.1 生物冶金的概念 生物冶金的概念
生物冶金是利用礦物為營養(yǎng)基質(zhì)的微生物的作用，將礦物中金屬溶解，進(jìn)分 離、富集、純化而提取金屬的濕法冶金技術(shù)。該技術(shù)具有流程短、成本低、環(huán)境 友好和低污染等特點(diǎn)，特別適于處理貧礦、廢礦、表外礦及難采、難選、難冶礦 的堆浸和就地浸出。從文獻(xiàn)記載來看，，中國是世界上最早采用生物冶金技術(shù)的國 家，早在公元前六、七世紀(jì)，就在采銅、鐵過程中不自覺地利用了自發(fā)生長的某 些自養(yǎng)細(xì)菌。而在歐洲，這種技術(shù)的應(yīng)用至少始于公元二世紀(jì)，從 1687 年開始， 瑞典中部 Falun 礦山的銅礦至少已經(jīng)浸出了 2 百萬噸銅[1]。 在國外，銅，鈾的生物提取以及含砷金礦的預(yù)氧化已實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。在銅的生 物提取方面， 目前用生物法提取的銅約占世界總銅產(chǎn)量的 25%， 在美國、 加拿大、 澳大利亞、智利等 20 多個(gè)國家實(shí)現(xiàn)了生物提銅產(chǎn)業(yè)化。在我國，也有 2 座銅的 生物氧化提取廠投入生產(chǎn)。在含砷金礦的生物預(yù)氧化方面，隨著自然金開采的日 益枯竭， 含砷難處理金礦己成為開采對(duì)象， 含砷金礦的主要礦物是黃鐵礦、 毒砂， 金以微粒成亞顯微形態(tài)包裹在硫化物中或浸染在黃鐵礦、毒砂的晶格中，細(xì)磨和 直接氰化法很難提取。而使用氧化亞鐵硫桿菌等細(xì)菌分解外部的包裹層，可使金 裸露出來，有利于化學(xué)浸出，從而提高金的回收率[2]。目前國外至少有 10 個(gè)生 物氧化提金廠己經(jīng)籌建投產(chǎn)，國內(nèi)也建成了 2 個(gè)生物預(yù)氧化黃金生產(chǎn)廠。在鈾的 生物提取方面，加拿大利用細(xì)菌浸鈾的規(guī)模最大、歷史最久，法國、美國、葡萄 牙等國家也實(shí)現(xiàn)了細(xì)菌浸鈾的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。
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目前世界范圍內(nèi)， 生物冶金成功應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)的主要是銅、 鈾和金銀等, 使用范圍從堆浸法逐步擴(kuò)展到了地浸法和原地破碎浸礦法，正在向銅、鈾、錳、 鉛、鎳、鉻、鉆、鐵、砷、鋅、鋁等幾乎所有硫化礦的浸出擴(kuò)大。產(chǎn)業(yè)化相對(duì)領(lǐng) 先的國家有智利、澳大利亞、美國、南非、日本等，中國、歐盟也從近幾年先后 投入大量資金開展生物冶金領(lǐng)域的研究�？v觀全球，生物冶金業(yè)化主要在三個(gè)方 面，并形成兩大技術(shù)[3]。

1.2 碲礦的生物冶金
碲是一種稀有，但有很大利用價(jià)值的非金屬資源。在地殼中的含量很少, 僅 有 2×10-7％， 其應(yīng)用相當(dāng)廣泛， 主要是用作鋼鐵有色金屬的添加劑, 其次是石油, 化工生產(chǎn)的催化劑,橡膠的硫化劑、促凝劑, 且在玻璃電子工業(yè)中有獨(dú)特用途。 目前，碲已經(jīng)成為世界戰(zhàn)略需求資源，從軍事到民用，碲都發(fā)揮著不可替代的作 用。碲礦物有碲金礦（AuTe2）、輝碲鉍礦(Bi2TeS2)和碲銅礦等，都很稀少。輝 碲鉍礦（tetradymite）是一種鉍和碲的硫化物礦物，它具有的淺灰色帶有金屬光 澤，并且還會(huì)褪色變暗。有葉、粒、塊狀等。輝碲鉍礦是一種較難獨(dú)立成礦的碲 硫化物。 在我國四川石棉縣大水溝發(fā)現(xiàn)的世界罕見的碲原生礦， 有很大開發(fā)前景。 此礦石含碲一般在 1%到 12%，個(gè)別高達(dá) 36.6%；含鉍一般在 3%到 20%，個(gè)別 達(dá) 40%以上 。由于碲礦分布相對(duì)分散，是一種低品位、難開采礦，同時(shí)統(tǒng)開采 方式易造成資源浪費(fèi)、環(huán)境污染、能源消耗過大等問題。而生物冶金正是能夠解 決上述困難的新發(fā)展方向
[12] [4]

。本文所用的礦樣為原礦經(jīng)浮選獲得的低品位碲精

礦，是以輝碲鉍礦為主的混合硫化礦，用單因子實(shí)驗(yàn)法進(jìn)行不同 pH 條件下?lián)u瓶 浸出試驗(yàn)，探究生物浸出時(shí)的一系列適宜條件，以期提高碲礦的生物浸出率。

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圖 1-1 輝碲鉍礦（tetradymite）

1.3 氧化亞鐵硫桿菌的作用 氧化亞鐵硫桿菌的作用
氧化亞鐵硫桿菌是嗜酸性化能自養(yǎng)型細(xì)菌, 專性好氧, 最佳生長pH值為 2.0～2.5, 最佳生長溫度28～35℃, 能以氧化Fe2 + 、 元素S及金屬硫化物等來獲得 生命過程中所需能量, 并以O(shè)2 作為氧化過程中的最終電子受體。這類細(xì)菌很早 就被應(yīng)用于貴金屬的浸出和回收, 適合于從低品位的礦石中浸出稀有貴金屬。細(xì) 菌浸出的方法由于具有成本低、能耗小、無污染等特點(diǎn)而獲得廣泛應(yīng)用, 據(jù)報(bào)道 美國有25%左右的銅是通過這種方法開采的[5]。此外在含硫廢水處理和煤的脫 硫、以及脫去硫化氫和二氧化硫等方面也有重要的應(yīng)用前景。然而由于氧化亞鐵 硫桿菌的野生菌氧化Fe2 + 、 元素S以及金屬硫化物的速度慢, 生長條件要求苛刻, 以及對(duì)某些金屬離子缺乏耐受能力等, 從而限制了其應(yīng)用范圍。所以人們?cè)噲D通 過各種馴化與誘變育種的方法來提高氧化亞鐵硫桿菌的適應(yīng)范圍和應(yīng)用價(jià)值。 在生物浸礦中，最常用的菌種是氧化亞鐵硫桿菌。由于各地的氧化亞鐵硫桿 菌不一樣，生長狀況不一樣，在各種環(huán)境中的含量也不同。所以在將其運(yùn)用到工 業(yè)生產(chǎn)中，首先要分離得到純的氧化亞鐵硫桿菌菌株。

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1.4 本實(shí)驗(yàn)研究內(nèi)容 本實(shí)驗(yàn)研究內(nèi)容
通過對(duì)氧化亞鐵硫桿菌的一些文獻(xiàn)資料的分析，總結(jié)前人已有的成果，從實(shí) 驗(yàn)室的浸礦溶液中分離出氧化亞鐵硫桿菌，前對(duì)其的一些基本生物活性進(jìn)行分 析。調(diào)整培養(yǎng)基的各種理化條件，使其最適合氧化亞鐵硫桿菌的生長，從而將此 生產(chǎn)條件調(diào)節(jié)到此環(huán)境，以使氧化亞鐵硫桿菌最大程度的進(jìn)行生物浸礦。 本文研究內(nèi)容：(1) 分離到氧化亞鐵硫桿菌菌株。 (2) 分析氧化亞鐵硫桿菌的生物學(xué)活性。

技術(shù)路線：

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二、實(shí)驗(yàn)部分 實(shí)驗(yàn)部分
2.1 實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備
2.1.1 菌種采集 本實(shí)驗(yàn)所用菌液為本實(shí)驗(yàn)室以前浸礦培養(yǎng)液。 2.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 蒸餾水，（NH4）2SO4(分析純)，KCI(分析純)，K2HPO4(分析純)， MgSO47H2O(分析純)，Ca(N03)2(分析純)，F(xiàn)eSO47H2O (分析純)，K 2Cr2O7(化學(xué) 純)，AgNO3(化學(xué)純)，二苯胺磺酸鈉(分析純)，KSCN(分析純)。 2.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 本章實(shí)驗(yàn)所用到的主要儀器及其型號(hào)和生產(chǎn)廠家如表 2 一 1 所示:
表 2 一 1 實(shí)驗(yàn)設(shè)備

儀器名稱
電子天平 精密 pH 計(jì) 臺(tái)式高速離心機(jī) 空氣浴振蕩器 數(shù)控恒溫浴鍋 電子分析天平 立式壓力蒸汽滅菌鍋 電熱恒溫培養(yǎng)箱 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱

型號(hào)
YJ2502

產(chǎn)地
上海精密科學(xué)儀器有限公司 上海雷磁儀器廠 德國漢堡 EppendorfCor. 哈爾濱市東明醫(yī)療器械廠 天津市泰斯特儀器有限公司 上海精密科學(xué)儀器有限公司 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠 上海一恒科技有限公司 上海一恒科技有限公司

PHS-3 C
5804R HZQ-C DK-98-1 FA1104N YXQ-S-301 DHP 一 9052 DHG9070A

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圖 2-1 部分儀器

2.1.4 培養(yǎng)基 氧化亞鐵硫桿菌的代表培養(yǎng)基是 9K 培養(yǎng)基和利森(Leathen)培養(yǎng)基，其組成 見圖 2-2。

圖 2-2

利森(Leathen)和 9K 培養(yǎng)基的組成[6]

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9K 富集培養(yǎng)基配置方法: 9K 鹽溶液: （NH4）2SO4,3.00g;KCl,0.10g; K2HPO4,0.50g;MgSO47H2O 0.50g; Ca(N03)2 0.01g;按此配方加蒸餾水配溶液 1000mL。 9K 培養(yǎng)基:為 9K 鹽溶液加入 FeSO47H2O 44.6g/L。 改進(jìn)的 9K 固體培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基由 A 液、B 液和 C 液三部分組成: A 液: （NH4）2SO4 1.5g;KCI 0.1g，K2HPO40.5g; MgSO47H2O 0.5g， Ca(N03)2 0.01g，KSCN15.4g，蒸餾水 200mL，121oC 滅菌 30min; B 液: FeSO47H2O 22g 蒸餾水 300mL，pH2.0，用微孔濾膜(Φ0.22um)過濾 滅菌; C 液:瓊脂糖 10g，蒸餾水 500mL，1210C 滅菌 20min。

2.2 研究方法 研究方法
2.2.1 菌種富集培養(yǎng) 菌種富集培養(yǎng) 實(shí)驗(yàn)中選用液體 9K 培養(yǎng)基對(duì)菌液進(jìn)行富集篩選。在 250mL 錐形瓶加入 200mL 滅菌后的 9K 鹽溶液和 4.46g FeSO47H2O， 50%的 H2SO4 調(diào)到 pH2.0 左 用 右，接種處于對(duì)數(shù)期生長的菌種 5mL，于 30℃、160r/min 搖床中恒溫震蕩培養(yǎng)。 經(jīng)過三到四次傳代培養(yǎng)，使得嗜酸氧化亞鐵硫桿菌成為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌[7]。 培養(yǎng)基由淺綠色逐漸加深，最后變?yōu)樽丶t色，溶液混濁，且有沉淀出現(xiàn)。這 表明液體培養(yǎng)基中 Fe2+被氧化成了 Fe3+，即有細(xì)菌生長。對(duì)該菌液進(jìn)行計(jì)數(shù)，發(fā) 現(xiàn)菌濃度己達(dá)到 107~108 個(gè)/ml。 2.2.2 分離純化 目前分離菌種主要采用以瓊脂(或瓊脂糖)作凝固劑的固體培養(yǎng)基進(jìn)行[8]。本 實(shí)驗(yàn)采用稀釋涂布平板法，步驟如下:取菌液 1mL，用 pH=2.5 的稀硫酸按每次稀 釋 10 倍，依次稀釋成 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6 濃度的稀釋液。吸取稀 釋度為 10-4、10-5、10-6 稀釋樣各 0.2mL，分別接種到三個(gè)預(yù)先準(zhǔn)備好的 9K 瓊脂
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固體培養(yǎng)基，涂布均勻，正置于 30℃恒溫生化培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，次日把培養(yǎng) 皿倒置繼續(xù)培養(yǎng)，直至固體培養(yǎng)基表面出現(xiàn)圓形凸起狀小菌落(直徑大約 1mm)， 一般需要兩周[9]。將單獨(dú)小菌落挑起，每個(gè)小菌落分別接種到裝有 5mL9K 液體 培養(yǎng)基的小錐形瓶(或試管)中，以棉球封口，放在 30℃搖床中進(jìn)行振蕩培養(yǎng)。這 樣培養(yǎng)出的即為單一菌的純培養(yǎng)[10]。如此反復(fù)，直到純化為止。操作均在無菌 工作臺(tái)上進(jìn)行，所有器皿均經(jīng)高壓濕熱滅菌，接種環(huán)用酒精燈灼燒消毒。

圖 2-3 2.2.3 單層平板的制作 培養(yǎng)基分為三部分制作： (1)9K 固體培養(yǎng)基([Fe2+]=9g/L)

分離過程圖

A 液:9K 無鐵液體培養(yǎng)基 42mL，pH3.0 B 液:1.5%瓊脂溶液 40mL C 液:14.78%FeS047H20 溶液 18mL (2)9K 固體培養(yǎng)基([Fe2+]=4.5g/L)
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A 液:9K 無鐵液體培養(yǎng)基 42mL，pH.30 B 液:1.5%瓊脂溶液 40mL C 液:7.39%FeS047H20 溶液 18mL 2.2.4 雙層平板的制作 在無菌平皿中倒入已溶化并冷卻至 60℃的瓊脂作底層，待平板凝固后，用 無菌吸管取 0.1mL 處于對(duì)數(shù)期的酵母菌菌液于底層平板并放置 1-2h。再分別將 用于分離 T.f 菌的固體培養(yǎng)基 A、B、C 液 3 者混合，迅速倒入混勻，作上層平 板，凝固后備用[11]。 2.2.5 革蘭氏染色 （1）用接種針挑取單個(gè)菌落，涂布于干凈載玻片上的一滴無菌水中，風(fēng)干 （2）滴加結(jié)晶紫染色液染 1-2 min，水洗，吸干； （3）用碘液沖去殘水，并用碘液覆蓋處理 1 min，水洗，吸干； （4）用 95%乙醇脫色，流滴至洗脫液無色，一般 20～30 s； （5）用番紅染液復(fù)染 2～3 min，水洗； （6）風(fēng)干后用顯微鏡油鏡觀察。 2.2.6 pH 測(cè)定 1、溶液 pH 值用奧立龍 818 型酸度計(jì)測(cè)定。 2、使用 pH 試紙進(jìn)行測(cè)定。 2.2.7 細(xì)菌計(jì)數(shù)方法 在測(cè)定細(xì)菌濃度時(shí)，細(xì)菌的計(jì)數(shù)方法較多，有顯微鏡直接測(cè)定法、平板計(jì)數(shù) 法、光電比濁法、生物量測(cè)定法及 DNA 含量測(cè)定法等[12]。考慮到直觀、起見， 本實(shí)驗(yàn)在菌種性質(zhì)的研究中， 細(xì)菌計(jì)數(shù)采用顯微鏡直接計(jì)數(shù)法， 這包括計(jì)數(shù)板法、 涂片染色法、比例計(jì)數(shù)法等，以計(jì)數(shù)板法最為常用，但該較費(fèi)時(shí)。該法是根據(jù)測(cè) 定對(duì)象選用特制的載玻片(即計(jì)數(shù)板)， 其上刻有己知面積的大小方格(即計(jì)數(shù)格)， 當(dāng)蓋上蓋玻片后，蓋玻片與計(jì)數(shù)格間的高度為已知，因此計(jì)數(shù)格的容積為一定。
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根據(jù)在顯微鏡下測(cè)得的該計(jì)數(shù)格中的微生物個(gè)數(shù)， 可算出單位體積待測(cè)液中所含 微生物數(shù)[13]。 該方法操作和步驟如下： (1)備片:取清潔干燥的計(jì)數(shù)板與蓋玻片(必要時(shí)，可微微烘干，以除去其上附 著的水分)，蓋上蓋玻片。注意蓋玻片要蓋在計(jì)數(shù)室兩側(cè)[14]。 (2)鏡檢計(jì)數(shù)室:在加樣前，先對(duì)計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)室進(jìn)行鏡檢。若有污物，則需 清洗后才能進(jìn)行計(jì)數(shù)。 (3)加樣:用無菌吸管吸取充分搖勻并打散開的待測(cè)菌液，小心滴一小滴于蓋 玻片邊緣，菌液自行滲入并布滿計(jì)數(shù)室，注意避免產(chǎn)生氣泡。 (4)顯微計(jì)數(shù):加樣后靜置 3~5 分鐘，鏡檢。根據(jù)受檢微生物個(gè)體大小選用適 宜的物鏡頭，先用低倍物鏡找好計(jì)數(shù)室位置，然后換用高倍物鏡進(jìn)行計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù) 前如發(fā)現(xiàn)菌液過濃，可做一定倍數(shù)稀釋后再制片鏡檢計(jì)數(shù)，一般每個(gè)小方格內(nèi)有 5~10 個(gè)菌體為宜。 一個(gè)計(jì)數(shù)室選 5 個(gè)中格(可選 4 個(gè)角和中央的中格)中的菌體進(jìn) 行計(jì)數(shù)。位于格線上的菌體一般只數(shù)上方和右邊線上的。計(jì)數(shù)時(shí)注意轉(zhuǎn)動(dòng)細(xì)調(diào)節(jié) 器，使液層上下菌數(shù)都可測(cè)到。每份菌液樣品至少計(jì)數(shù)兩次取其均值[8]。 (5)清洗血球計(jì)數(shù)板:使用完畢后，將血球計(jì)數(shù)板在水龍頭上用水柱沖洗，切 勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用吹風(fēng)機(jī)吹干。鏡檢，觀察每小格內(nèi)是否有殘 留菌體或其他沉淀物。若不干凈，則必須重復(fù)洗滌至干凈為止。 (6)結(jié)果計(jì)算:一個(gè)計(jì)數(shù)室就是一個(gè)大方格，分為 25 個(gè)中方格，而每個(gè)中方格 又分成 16 個(gè)小方格，所以每個(gè)計(jì)數(shù)室中的小方格數(shù)都是 16X25=400 個(gè)。每一個(gè) 大方格邊長為 1mm，則每一個(gè)計(jì)數(shù)室的面積為 1mm2，蓋上蓋玻片后，載玻片與 蓋玻片之間的高度為 0.1mm，所以計(jì)數(shù)室的容積為 0.1mm3。在計(jì)數(shù)時(shí)，通常數(shù) 五個(gè)中方格的總菌數(shù)，然后求得每個(gè)中方格的平均值，再乘上 25，就得出一個(gè) 計(jì)數(shù)室中的總菌數(shù)，然后再換算成 1mL 菌液中的總菌數(shù)。 設(shè)五個(gè)中方格中總菌數(shù)為 A，菌液稀釋倍數(shù)為 B，那么，一個(gè)計(jì)數(shù)室的總菌 數(shù)（即 0.1mm3 中的總菌數(shù)）為（A/5）*25*B；因此 1mL=1000mm3，故 1mL 菌 液中的總菌數(shù)=（A/5）*25*B*10*1000=50000A*B 個(gè)。
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2.4 生物特性研究
2.4.1 生長曲線 將預(yù)先培養(yǎng)好的細(xì)菌分別接種于亞鐵和元素硫的培養(yǎng)基中(接種終濃度為 10×106個(gè)/mL),在25~60℃或30℃及pH 10~50的條件下?lián)u床培養(yǎng),2天后每隔 4~8 h取樣,用血小板計(jì)數(shù)法測(cè)定細(xì)菌的數(shù)量[15]。 2.4.2 氧化亞鐵硫桿菌菌株對(duì)能源的利用情況 在 100 mL 基本鹽培養(yǎng)基中分別加入 1 g 除菌的單質(zhì)硫或 431 g FeSO47H2O 和 1 g 單質(zhì)硫的混合物、硫代硫酸鈉、葡萄糖、酵母粉、蛋白胨、黃鐵礦和鐵閃 鋅礦,分別配成含硫或亞鐵和硫、硫代硫酸鈉、不同碳源、不同礦樣的特別基質(zhì). 然后,按 2.4.1 方法接種,在 30℃條件下分別培養(yǎng) 5 天后,觀察細(xì)菌的生長情況. 2.4.3 最適生長溫度的測(cè)定 分別 將相同數(shù)量的氧化亞鐵硫桿菌株接種到多份 9 K 葡萄糖液體培養(yǎng)基中， 置于不同溫度條件下，經(jīng) 170 r/min 振蕩培養(yǎng)，第 72 h 時(shí)，在顯微鏡下直接計(jì)數(shù)， 確定不同溫度下菌株的生長情況[16]。 2.4.4 最適初始 pH 值的測(cè)定 將相同數(shù)量的氧化亞鐵硫桿菌株接種到不同初始 pH 值的 9K 葡萄糖液體培 養(yǎng)基中，經(jīng) 30℃、170 r/min 振蕩培養(yǎng)，第 72 h 時(shí)于顯微鏡下直接計(jì)數(shù)，確定不 同 pH 條件下細(xì)菌的生長情況。

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結(jié)果與討論 果與討論
通過本次實(shí)驗(yàn)，綜合各項(xiàng)數(shù)據(jù)，進(jìn)行分析： 1、菌種來源：本實(shí)驗(yàn)采用實(shí)驗(yàn)室原有的浸礦溶液 對(duì)研究者與使用者來說，工業(yè)微生物即浸礦菌種的獲得一般有兩種方法： （1）從微生物保存單位直接購買。這樣可以節(jié)省時(shí)間，并減少工作量，但 這樣獲得的菌種常常沒有從自然界采集的野生菌適應(yīng)性強(qiáng)[12]。 （2）直接從自然界中采集野生菌。這種細(xì)菌適應(yīng)性強(qiáng)，故人們常常從自然 界中采集。 2、細(xì)菌形態(tài)結(jié)構(gòu) 革蘭氏染色，觀察細(xì)菌形態(tài)。菌體形態(tài)特征：該菌在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)時(shí),培養(yǎng) 基的顏色由最初的淺綠色變?yōu)辄S綠色,約 10 天左右在培養(yǎng)皿上長出小菌落,該菌 落為黃褐色、 圓形,直徑約 0. 5—0. 8mm,中部突起,被水合高鐵包裹,質(zhì)地堅(jiān)硬,較難 挑起[17]。在顯微鏡下該菌為短桿狀,兩端鈍圓,以單個(gè)、雙個(gè)或幾個(gè)呈短鏈狀存在, 能運(yùn)動(dòng),革蘭氏染色陰性。

圖 2-4 細(xì)菌顯微結(jié)構(gòu)

3、9K 固體培養(yǎng)基制作
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固體培養(yǎng)基本可由液體培養(yǎng)基中加入一定比例的瓊脂直接制成， 但因瓊脂在 酸性環(huán)境中易于水解，在本實(shí)驗(yàn)中只有將培養(yǎng)基與瓊脂分開滅菌后混合制平板。 A、B 液 121℃濕熱滅菌 15min，C 經(jīng) 0.22um 微孔濾膜過濾除菌，待 A、B 液冷 卻到 60℃與 C 液混合后倒平板，待平板冷卻凝固后即可進(jìn)行菌液的涂布。 4、營養(yǎng)類型：化能自養(yǎng)菌 在富集培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)中,隨著菌體的生長, 9K 液體培養(yǎng)基的顏色由淺綠色依次 變?yōu)橥咙S色和紅棕色,這是由于溶液中 Fe2+被氧化成 Fe3+,最終有淡黃色黃鉀鐵礬 沉淀生成;實(shí)驗(yàn)還表明該菌能利用亞鐵和單質(zhì)硫生長,但在蛋白胨培養(yǎng)基中不能生 長,所以該菌屬專性化能自養(yǎng)菌。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該菌具有氧化亞鐵硫桿菌的 特性。 5、生長曲線 生物氧化過程中 Fe2+濃度以及細(xì)胞數(shù)目隨時(shí)間變化如圖，T.f 生長進(jìn)入穩(wěn)定 期，細(xì)菌濃度達(dá)到最大值 1.3x107 個(gè)/mL。穩(wěn)定期可以持續(xù)到第 7d，然后進(jìn)入衰 亡期[18]。與對(duì)照相比，接種處理的培養(yǎng)液中 Fe2+氧化主要發(fā)生在延滯期間，兩天 后 Fe2+基本耗盡。

圖

2-4

氧化亞鐵菌菌株的生長曲線
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6．能源利用情況 圖 2-5 為氧化亞鐵菌菌株亞鐵培養(yǎng)基和硫培養(yǎng)基中的典型生長曲線.由圖 2 可知,培養(yǎng)早期細(xì)菌在亞鐵培養(yǎng)基中的增長速度明顯比在硫培養(yǎng)基中的快,但 100 h 后,在硫培養(yǎng)基中的細(xì)菌濃度明顯高于在亞鐵培養(yǎng)基中的細(xì)菌濃度,細(xì)菌濃度達(dá) 到 108 個(gè)/mL.細(xì)菌在利用元素硫時(shí),需要經(jīng)過一段時(shí)間誘導(dǎo)自身表達(dá)或合成分泌 性疏水胞外物質(zhì),以利于與元素硫接觸,因而在開始階段細(xì)菌的濃度較低.但一旦 接觸好后,硫氧化比亞鐵氧化可提供更多的能量,所以培養(yǎng)后期細(xì)菌的濃度較高。

圖 2-5

氧化亞鐵菌菌株在亞鐵和硫培養(yǎng)基中的生長曲線

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結(jié)論
本次實(shí)驗(yàn)，通過將氧化亞鐵硫桿菌菌液進(jìn)行倒平板，采用劃線分離法，得到 氧化亞鐵菌株，再進(jìn)行生物特性的研究，得出以下結(jié)論： （1）從實(shí)驗(yàn)室樣品中分離純化得到細(xì)菌菌株，觀察：固體培養(yǎng) 10 天后出現(xiàn) 菌落，均為黃褐色，圓形，直徑 1mm，中部突出，質(zhì)地堅(jiān)硬�？梢岳脕嗚F和 單質(zhì)硫作為能源。 （2）T.ferrooxidans 菌在亞鐵培養(yǎng)基中遲緩時(shí)間短，比生長速率高，倍增時(shí) 間短，說明硫酸亞鐵相對(duì)于單質(zhì)硫是一種速效能源。 (3)在硫培養(yǎng)基中 T.ferrooxidans 菌出現(xiàn)二次，甚至更多次的對(duì)數(shù)生長，最終 細(xì)菌濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于亞鐵培養(yǎng)基中的細(xì)菌濃度，說明單質(zhì)硫是一種長效能源，能提 供比亞鐵更高的能量。 (4)對(duì)最佳生長條件的研究表明,在初始 pH 值為 2～2. 5 ,溫度在 30～35 ℃范 圍內(nèi),初始 Fe2+度為 9 g/ L ,接種量為 10 %時(shí),菌株既能維持良好的生長,又能對(duì) Fe2+的氧化速率保持較高水平。下一步將通過傳統(tǒng)誘變技術(shù)和現(xiàn)代基因工程手段 改良該菌株,使其滿足工業(yè)化生產(chǎn)的需求。

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致謝
經(jīng)過半年的忙碌和工作，本次畢業(yè)設(shè)計(jì)已經(jīng)接近尾聲，作為一個(gè)本科生,在 完成畢業(yè)設(shè)計(jì)過程中，由于經(jīng)驗(yàn)的匱乏，難免有許多考慮不周全的地方，如果沒 有導(dǎo)師的督促指導(dǎo)，以及一起工作的同學(xué)們的支持，想要完成這個(gè)設(shè)計(jì)是難以想 象的。 在這里首先要感謝我的導(dǎo)師謝鴻觀老師。 謝老師平日里工作繁多，但在我做 畢業(yè)設(shè)計(jì)的每個(gè)階段，從查閱資料，設(shè)計(jì)草案的確定和修改，中期檢查，后期 數(shù)據(jù)分析等整個(gè)過程中都給予了我悉心的指導(dǎo)。除了敬佩謝老師的專業(yè)水平 外，他的治學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)和科學(xué)研究的精神也是我永遠(yuǎn)學(xué)習(xí)的榜樣，并將積極影響我 今后的學(xué)習(xí)和工作。 其次要感謝生物工程辦公室雷濘菲、童晉等老師在實(shí)驗(yàn)室的細(xì)心指導(dǎo)和李先 鋒、何超等同學(xué)們?cè)谧鰧?shí)驗(yàn)過程中對(duì)我的幫助，他們?cè)诒敬卧O(shè)計(jì)中都給了我很大 的幫助。另外，在完成實(shí)驗(yàn)及本論文的撰寫過程中，還得到了很多其他老師和同 學(xué)的關(guān)心與幫助。感謝生物工程專業(yè)所有老師授予我的專業(yè)知識(shí)，才使我有能力 完成畢業(yè)設(shè)計(jì)。感謝我的室友們?cè)诖舜萎厴I(yè)論文的完成中給予我的幫助，才能使 我順利的完成畢業(yè)論文。在此我對(duì)幫助、關(guān)心、支持我的老師和同學(xué)表示最誠摯 的謝意。 最后，特別感謝關(guān)愛我的父母，沒有他們一直以來的無私支持和鼓勵(lì)，本論 文無法順利完成，是他們一直默默的給予我無限的精神支持與勇氣。 再次表達(dá)我對(duì)所有幫助我、關(guān)心我的人的最誠摯的謝意！

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