鹽脅迫下植物基因的表達與基因工程研究進展[1]47

發(fā)布時間：2016-07-13 19:07

本文關(guān)鍵詞：鹽脅迫下植物基因的表達與基因工程研究進展，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

武漢植物學(xué)研究2005,23(2):188～19；JournalofWuhanBotanicalR；鹽脅迫下植物基因的表達與基因工程研究進展；張改娜,何濤,王學(xué)仁,賈敬芬；(西北大學(xué)生物技術(shù)省級重點實驗室,西安71006；摘要:在各種環(huán)境脅迫中,鹽脅迫是造成作物減產(chǎn)的嚴；中圖分類號:Q943.2文獻標識碼:A文章編號:；ProgressofGeneExpre

武漢植物學(xué)研究2005,23(2):188～195

JournalofWuhanBotanicalResearch

鹽脅迫下植物基因的表達與基因工程研究進展

張改娜,何濤,王學(xué)仁,賈敬芬

(西北大學(xué)生物技術(shù)省級重點實驗室,西安　710069)

摘　要:在各種環(huán)境脅迫中,鹽脅迫是造成作物減產(chǎn)的嚴重環(huán)境因素之一。隨著植物分子生物學(xué)快速發(fā)展,植物耐鹽性研究已深入到耐鹽相關(guān)基因的克隆、基因的結(jié)構(gòu)分析以及基因表達領(lǐng)域。文中就與植物耐鹽性密切相關(guān)的小分子滲透物質(zhì)、晚期胚胎發(fā)生富集蛋白(LEA)、通道蛋白、鹽脅迫相關(guān)基因、信號傳導(dǎo)基因和轉(zhuǎn)錄因子研究作了綜述。同時對植物耐鹽性研究作了簡單的展望。關(guān)鍵詞:鹽脅迫;滲透調(diào)節(jié)劑;調(diào)控基因;基因工程

　　中圖分類號:Q943.2　　　　　文獻標識碼:A　　　　　文章編號:10002470X(2005)0220188208

ProgressofGeneExpressionandGeneEngineering

ofSalt-toleranceinPlant

ZHANGGai2Na,HETao,WANGXue2Ren,JIAJing2Fen

(ProvincialKeyLaboratoryofBiotechnology,NorthwestUniversity,Xi’an　710069,China)

Abstract:Amongvariousabioticstresses,thesaltstressisoneofthemostsevereenvironmental

factorsresponsibleforthereductionofcropyield.Withthedevelopmentofmolecularbiology,theresearchofsaltstressmadegreatprogressingenecloning,analysisofitsstructureandgeneexpression.Thispaperreviewedsmallmolecularosmoticsubstances,Lateembryogensisabun2dantproteins,channelproteins,saltstress2relatedgenes,signaltransductiongenes,transcrip2

.Meanwhileprospectsfortheresearchareprovided.tionalfactors

Keywords:Salinity2stress;Osmotin;Regulatinggene;Geneengineering

　　土壤鹽漬化是當(dāng)今世界普遍關(guān)注的問題之一,嚴重影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)環(huán)境,尤其對甜土植物(只能生存在低于50mmol??L鹽量)的生長造成很大影響。而大多數(shù)農(nóng)作物為鹽敏感的甜土植物,因此對植物耐鹽機理的研究一直受到研究者們的高度重視[1]。20世紀80年代以來,許多學(xué)者利用細胞培養(yǎng)體系從事抗鹽性的分子生物學(xué)研究,希望確定抗鹽的遺傳性和與抗鹽性相對應(yīng)的基因。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展,積累了越來越多的鹽應(yīng)答資料,為最終搞清植物對鹽脅迫影響的分子機制,并利用這些知識改良作物,使之適應(yīng)不良的鹽漬化環(huán)境奠

定了基礎(chǔ)。鹽對植物的傷害包括兩個方面:其一,土壤中較高的溶質(zhì)濃度造成的植物滲透脅迫;其二,植物吸收水分的同時吸收了過多的鹽離子造成的離子毒害,特別是鈉離子毒害。鹽生植物雖能適應(yīng)高鹽環(huán)境,但其胞質(zhì)內(nèi)的酶并不能適應(yīng)高Na+水平,從而表現(xiàn)出與甜土植物同樣的Na+敏感性。筆者針對鹽脅迫引起的植物滲透調(diào)節(jié)和抗鹽基因工程方面的研究作一概述,以促進植物轉(zhuǎn)抗旱基因的研究工作。

1　植物鹽脅迫滲透調(diào)節(jié)劑與其基因系統(tǒng)表達

　　當(dāng)植物受到干旱、高鹽等滲透脅迫時,植物為了

收稿日期:2004212202,修回日期:2005202228。

基金項目:陜西省自然科學(xué)基金重點項目(2003C108)資助;陜西高校重點實驗室項目資助。

作者簡介:張改娜(1977-),女,在讀博士,現(xiàn)從事植物細胞工程和基因工程研究(E2mail:zgnluck1@163.com)。Ξ通訊作者。

減緩脅迫造成的不平衡,通常在細胞內(nèi)積累一些滲透保護物質(zhì)(osmoprotectant)以降低細胞內(nèi)的滲透勢,提高細胞的吸水力。滲透保護物質(zhì)一般分兩類:一類是小分子有機化合物,如脯氨酸、甜菜堿、糖醇等;另一類是蛋白質(zhì)。這些滲透保護物質(zhì)能增加細胞的保水能力而不干擾細胞內(nèi)正常的生化反應(yīng),因此將它們通稱為細胞相溶性溶質(zhì)(compatible

[2,3]

,又稱滲透調(diào)節(jié)劑。solute)

1.1　與鹽脅迫相關(guān)的小分子化合物

betA基因能在多種植物的葉綠體基質(zhì)或細胞質(zhì)中

表達,顯著地起到保護細胞的作用。例如:將CodA

基因轉(zhuǎn)化到藍細菌Synechococcussp.PCC7942、水稻OryzasativeL.和擬南芥Arabidopsisthalianap這些不能天然合成甘氨酸甜菜堿的植物中,植物的調(diào)滲功能,對鹽堿、干旱等逆境的抗性就會增強。

催化由膽堿合成甜菜堿的關(guān)鍵酶——細菌甜菜堿醛脫氫酶基因(betB)和植物甜菜堿醛脫氫酶基因(BADH)也已經(jīng)被克隆定位,并利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)轉(zhuǎn)入部分甜土植物中。研究表明,BADH基因受鹽脅迫誘導(dǎo),在脅迫條件下,BADH基因轉(zhuǎn)錄水平的提高和表達量的增加還具有保護其它重要酶類,保護類囊體膜的光系統(tǒng)??免受損傷[12],提高主要抗氧化酶活性、改善其它生理過程[13]的間接作用。植物

耐旱基因工程中研究較深BADH基因是目前抗鹽、

入的基因之一。它在植物中的定位因植物種類不同

而有很大差異,在藜科、莧科等植物中,BADH基因主要存在于葉綠體基質(zhì)中;而水稻和大麥的BADH基因主要存在于過氧化物酶體中。這可能與BADH基因缺乏信號肽有關(guān)[13]。雖然這些滲透調(diào)節(jié)劑可提高轉(zhuǎn)基因植株的抗鹽能力,但抗鹽性只是相對的。

多胺在植物體內(nèi)除對植物的生長發(fā)育起調(diào)節(jié)作用外,可能作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)還在植物受到環(huán)境脅迫時起作用。在多胺合成中,ADC、ODC和SAMDC脫羧酶起關(guān)鍵作用,這3種酶均已純化和鑒定,它們的基因也已從多種植物中得到了克隆。李子銀等[14]在水稻中發(fā)現(xiàn)了S2腺苷蛋氨酸脫羧酶(SAMDC)基因,水稻翻譯延伸因子IA蛋白(eEFIA)基因家族中的新成員(稱REFIA)的基因轉(zhuǎn)錄均受鹽脅迫的誘導(dǎo),還發(fā)現(xiàn)一功能未知的新基因SRGA受鹽脅迫的抑制。脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白基因是近年來研究較多的受非生物脅迫誘導(dǎo)的多基因家族之一[15]。該基因是誘導(dǎo)型基因,其轉(zhuǎn)錄受MYC和MYB相關(guān)蛋白的調(diào)控[16],位于TaLTP基因啟動子上游337bp處的該基因的順式作用元件,控制其轉(zhuǎn)錄[17]。1.2　鹽脅迫蛋白

近年來,人們發(fā)現(xiàn)了一種新的蛋白質(zhì)稱為調(diào)滲蛋白(osmotin),它在調(diào)節(jié)細胞的滲透勢方面也起著

[18]

很重要的作用。Ericson最先報道了煙草鹽適應(yīng)懸浮細胞中存在鹽脅迫蛋白,隨后獲得了該蛋白的

番茄、玉米、大麥、甜cDNA克隆。此后又發(fā)現(xiàn)蘿卜、

自然界中存在著一類無毒小分子化合物,被稱作滲透保護劑,小分子細胞相容性溶質(zhì)主要有3種:

一是氨基酸類,如脯氨酸等;二是季胺類化合物,如甜菜堿和磷酸膽堿等;三是糖醇類化合物,如甘露醇和山梨醇等。這3種物質(zhì)都有較大水溶性,能調(diào)節(jié)滲透勢,但又能進入蛋白質(zhì)的水化膜內(nèi),不僅不會破壞蛋白質(zhì)的卷曲結(jié)構(gòu),反而由于被排斥在膜的外表而又益于保護和穩(wěn)定細胞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu),防止酶變性失活[4,5]。他們的調(diào)節(jié)機制及合成途徑在許多有關(guān)水分脅迫的綜述中都有報道,本文不再贅述。

[6]

Tarazynski等首次報道用基因工程手段可以提高轉(zhuǎn)基因植物的耐鹽性。他們用從Escherichiacoli中分離出的12磷酸甘露醇脫氫酶基因(mtlD)轉(zhuǎn)化煙草,使轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生并積累甘露醇(而轉(zhuǎn)化的對照株未檢測到)。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將該基因轉(zhuǎn)化八里莊楊,也得到了耐鹽植株[7]。目前,在擬南芥、西紅柿中都已克隆出催化由谷氨酸合成脯氨酸代謝途徑中的關(guān)鍵酶——吡咯啉252羧酸合成酶基因(P5CS),并利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)已將該合成酶基因(P5CS)導(dǎo)入煙草。脯氨酸在轉(zhuǎn)基因煙草體內(nèi)的合成量增加了10～18倍;在干旱條件下根的生長量顯著高于非轉(zhuǎn)基因煙草,而且還促進花的發(fā)育[8]。菠菜和甜菜等植物中合成甜菜堿的膽堿單氧化酶(CMO)的基因也已被克隆并定位于葉綠體基質(zhì)中,該基因是利用光合作用產(chǎn)生的鐵氧還蛋白作為電子受體的,因此單獨轉(zhuǎn)化CMO基因的轉(zhuǎn)基因植物也可以完成甜菜堿的合成。如轉(zhuǎn)CMO基因的煙草可以正常表達CMO,且與鹽脅迫無關(guān),能在1.17%NaCl鹽濃度中生長良好[9]。

CodA和betA基因分別是細菌中編碼催化膽堿氧化生成甜菜堿的膽堿氧化酶(COX)和膽堿脫氫酶(CDH),它們均兼具植物膽堿單氧化酶和甜菜堿醛脫氫酶的雙功能性,即能獨立催化膽堿轉(zhuǎn)化為甘氨酸甜菜堿[10,11],這種雙功能使得轉(zhuǎn)化單個基因就能使植物具有積累甘氨酸甜菜堿的能力。CodA和

菜等許多作物中存在鹽脅迫蛋白,尤以分子量為26kD為代表的蛋白質(zhì)含量在鹽脅迫下顯著增加�？烧伎偟鞍椎�10%～12%,且增加量與總蛋白量之

比率呈正相關(guān),同時也發(fā)現(xiàn)新蛋白合成總是滲透調(diào)解過程的開始。1995年對調(diào)滲蛋白基因的啟動子結(jié)構(gòu)和功能進行研究,調(diào)滲蛋白啟動子有3個保守序列:類似G2box序列;類似AT21box序列,5′2AAT

;一個被乙烯誘導(dǎo)的類調(diào)滲蛋白TATTTTATG23′

的啟動子高度保守序列,5′2TAAGA??CGCCGCC2

3′。這3個保守序列可保護DNA免被DNase消化,影響啟動子的活性[19]。目前已得到由農(nóng)桿菌介導(dǎo)的將調(diào)滲蛋白啟動子和葡萄糖苷醛酶報告基因嵌合在一起的轉(zhuǎn)基因煙草,其在鹽漬條件下調(diào)滲蛋白基因轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)基因植物的抗性比對照組都有明顯的提高。調(diào)滲蛋白基因表達受轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)節(jié),脫落酸誘導(dǎo)編碼調(diào)滲蛋白mRNA的合成并使其穩(wěn)定,但是只有調(diào)滲脅迫才能導(dǎo)致調(diào)滲蛋白的積累。1.3　晚期胚胎發(fā)生富集蛋白(LEA蛋白)

晚期胚胎發(fā)生富集蛋白(LEA蛋白)基因是第一個鑒定的在種子成熟和發(fā)育階段表達的基因[20],該類基因在受到干旱和鹽漬等環(huán)境脅迫而脫水的營養(yǎng)組織中表達。以它普遍存在的氨基酸序列為基礎(chǔ),LEA蛋白被分為6組。LEA蛋白家族之一的group1(D219family)LEA蛋白有較多帶電荷氨基酸,有較強的親水性。group2LEA蛋白C端有15個氨基酸保守序列:EEKGIMDKIKELPG,可能起到通道蛋白的作用。group3(D27family)LEA蛋白有一保守的氨基酸基元:TAQAAKEKAGE,在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中重復(fù)13次。這個基元形成一個兩性的a2螺旋,親水的一面形成雙聚體,外面帶電荷的一面在細胞處于缺水狀態(tài)下中和濃度過高的離子。group4(D2113family)LEA蛋白N端有保守的a2螺旋,能保護細胞膜的功能。group5(D229family)LEA蛋白在結(jié)構(gòu)和功能上相似于group3LEA蛋白,有一個11氨基酸重復(fù)序列,具有中和離子的功能。根據(jù)LEA蛋白自身的結(jié)構(gòu),推測group3LEA蛋白功能可能是在種子成熟,干燥過程中和滲透脅迫條件下保護細胞免受水勢降低的損傷。編碼這類蛋白的基因稱為Lea基因,高等植物普遍存在著該基因。從許多作物中都已克隆到相應(yīng)的Lea基因,包括大麥的HVA1基因,小麥的PMA2005、、PMA1959

、PMA1949基因,大豆的GmPM2基因,棉花的D27

、、、D2113D229D219D234基因,胡蘿卜的Dc3和Dc8基因,葡萄種子的PLEA76基因。根據(jù)Lea基因所編碼的LEA蛋白分組類型,Lea基因也被分成相應(yīng)的組。研究較多的是group3Lea基因。這類基因包括大麥的HVA1基因,小麥的PMA2005、大豆的

、、GmPM2PMA1949基因,棉花的Lea基因D27D229基因,葡萄種子的PLEA76基因以及胡蘿卜的

Dc3和Dc8基因。Lea基因雖然是在種子成熟和發(fā)

育階段特異表達的基因,但也可在植物受到干旱、鹽

漬等環(huán)境脅迫后造成脫水的營養(yǎng)組織中表達。1996年XuDeping用大麥的HVA1基因進行轉(zhuǎn)基因水稻研究,轉(zhuǎn)基因水稻獲得高的耐鹽性。這一結(jié)果直接證明了Lea基因表達特點和LEA蛋白功能假說。Lea基因可作為一種抗脅迫遺傳工程的潛在的分子工具[19]。

1.4　通道蛋白(channelprotein)

高鹽環(huán)境導(dǎo)致細胞內(nèi)離子及水平衡的破壞,跨膜通道蛋白在恢復(fù)離子平衡方面起著關(guān)鍵的作用。如植物消除Na+毒害的策略,包括Na+外排和區(qū)隔

化。這些過程主要有Na+??H逆向轉(zhuǎn)運蛋白來調(diào)節(jié),而這一逆向轉(zhuǎn)運又需要質(zhì)膜H+2ATPase和液泡+++H移位酶H2ATPase和H2PPiase產(chǎn)生跨膜的

+++H電化學(xué)勢梯度,為Na??H逆向轉(zhuǎn)運蛋白提供驅(qū)++動力。其分子機制在“Na??H逆向轉(zhuǎn)運蛋白和植物耐鹽性[21]中有詳細闡明。利用同源性克隆,差異顯示,擬南芥突變體等技術(shù)已克隆到:Na+2ATPase基

因HANA。目前,在高等植物中還沒有發(fā)現(xiàn)Na+2

ATPase的存在;P2H2ATPase基因,V2H2AT2

Pase基因都是多基因控制的。P2H2ATPase基因在擬南芥中至少有10個ANA基因,多基因家族的每個基因都在自己的啟動子控制之下,按照特定組

織的功能和要求有效地表達。V2H2ATPase基因有一些屬于管家基因,其它一些基因受組織或細胞

特異性控制。V2H2ATPase基因除組織特異性外,在當(dāng)植物處于有限的ATP供應(yīng)條件下,起關(guān)鍵作用。這些基因在于高等植物耐鹽機制相似的酵母突變體中過量表達,可以提高菌株的耐鹽性[22]。Blumwald等利用基因工程手段在番茄中過量表達

++Na??H逆向轉(zhuǎn)運蛋白,得到了世界上第一批真正

意義上的耐鹽作物,用200mmol??LNaCl澆灌轉(zhuǎn)基因植株,仍可正常生長并結(jié)實[23]。

植物水通道蛋白(aquaporin,AQP)及其相關(guān)基因的研究也有一定進展。AQP是膜內(nèi)在蛋白家族(membranceintrinsicprotein,MIP)的成員,根據(jù)其細胞定位和序列同源性可分為質(zhì)膜內(nèi)在蛋白(plas2液泡膜內(nèi)在蛋白(tono2maintrinsicprotein,PIP)、

plastintrinsicprotein,TIP)和nodulin2likeMIP(NLM)3類。AQP大量存在于參與水分、離子集流

的細胞中,負責(zé)水分的快速跨膜轉(zhuǎn)運,也可能參與長

距離或短距離的胞間水分運動,以及液泡與胞質(zhì)間、胞質(zhì)與質(zhì)外體間的滲透調(diào)節(jié)[24]。植物基因組含有大量的MIP基因。例如,擬南芥中已發(fā)現(xiàn)了23種

[24]

MIP轉(zhuǎn)錄子,玉米中至少有30種MIP基因。

組織、細胞特MIP基因的表達表現(xiàn)出明顯的器官、

異性,各種環(huán)境因子如干旱、鹽漬等對MIP基因也

有明顯的調(diào)控作用[25]。滲透脅迫處理后,Yamada等[26]從冰葉午時花根的cDNA文庫中分離了水通道蛋白(aquapori)基因,分別命名為MipA、MipB、MipC。其中MipA、MipB是全長序列,分別有1272bp和1267bp,MipC是部分序列。MipA、MipC在

[33]

NGAL39和CDPK9之間,SOS3基因編碼鈣結(jié)

合蛋白,SOS3的鈣結(jié)合特性在決定植物在Na+脅迫下鈣信號的特殊性方面可能起重要作用。

目前,國內(nèi)利用mRNA差異顯示,PCR技術(shù)等分子生物學(xué)技術(shù)對許多農(nóng)作物在鹽脅迫下應(yīng)答基因進行研究。王振英等在研究黑麥鹽脅迫時,發(fā)現(xiàn)了

[34]

在辣椒SI800,SI650,SI3503個與鹽脅迫相關(guān)基因。中發(fā)現(xiàn)了非典型的類LEA蛋白基因新家族Ca2

LEAL1基因,Ca2LEAL1能被干旱和鹽脅迫強烈激活,且ABA和乙烯利能提高其轉(zhuǎn)錄水平[35]。許多研究還表明,植物的許多基因的表達與調(diào)控具有器官組織差異性。在氯化鈉脅迫下冰葉日中花葉中的PEP羧化酶基因表達增加30倍,而在根中卻下降[36]。解除脅迫后,植物再水化的恢復(fù)過程也涉及多基因的轉(zhuǎn)錄[37],這些基因產(chǎn)物不僅與再水化有關(guān)也與植物細胞的生長和伸長有關(guān)[17]。脯氨酸脫氫酶proDH基因是植物再水化過程過量表達的基因,它

根和葉中表達,MipB在根中表達。在鹽脅迫剛開始時,MipA、MipB、MipC表達水平降低,隨后又恢復(fù)到以前水平。MipA、MipC的mRNA水平的波動變化與鹽脅迫下葉子的膨壓變化相一致。

2　植物鹽誘導(dǎo)基因及其表達系統(tǒng)

植物抗鹽性由多種基因控制且其作用機制相當(dāng)復(fù)雜。就某一具體抗鹽性狀而言,單個或少數(shù)幾個基因起著一份可測量的抗性作用,所以,抗鹽基因的分離和鑒定是很有意義的[27]。該領(lǐng)域的研究熱點是利用模式植物擬南芥進行耐鹽的遺傳突變分析,進而分離、克隆耐鹽基因[28]。通過誘變方法得到大約250000株擬南芥,分離,克隆得到的耐鹽基因可分為5組,其中SOS1、、SOS2SOS3研究較詳細。SOS1定位于擬南芥2號染色體,SOS1編碼了一個1146個氨基酸殘基的多肽,該多肽的分子量是127kD,SOS1的C2末端為親水區(qū),N2端具有高度疏水特性,并帶有12個轉(zhuǎn)膜區(qū)域[29]。胞質(zhì)中,親水的C2端尾部

使SOS1成為已知的最大的Na+??H逆向轉(zhuǎn)運因子[30]。SOS1的表達都是由NaCl脅迫因子正調(diào)節(jié)的,這個正調(diào)控是與SOS??耐Na+的作用相一致的。NaCl脅迫因子也正調(diào)節(jié)著編碼質(zhì)膜H+2ATP酶的基因的表達,H+2ATP酶表達的加強能提高質(zhì)

子轉(zhuǎn)運的能力,這對提高Na+??H逆向轉(zhuǎn)運因子的活性具有重大意義[29]。SOS2基因定位于5號染色體,編碼一個假定的絲氨酸??蘇氨酸蛋白激酶,其N2端大約有270氨基酸,它組成激酶的催化區(qū)域,SOS2的C2端是它的調(diào)控區(qū)域。該激酶能控制和激活K+和Na+轉(zhuǎn)運蛋白的活性,其活性是Ca2+調(diào)控的[31],SOS2的C2端調(diào)控區(qū)域在植物耐鹽功能方面也起著必不可少的作用[32]。SOS3基因是耐鹽的必需基因,也是植物在低K+培養(yǎng)基上生長的必需基因,SOS3基因也位于5號染色體上,在分子標記

是降解脅迫條件下積累的脯氨酸[38]。proDH基因的啟動子上游存在一個ACTCAT順式作用元件,控制再水化誘導(dǎo)基因的表達[39]。

3　鹽脅迫調(diào)節(jié)基因的研究

植物感受脅迫信號后,調(diào)控敏感基因的表達,這些基因的表達受其啟動子附近順式作用元件以及與之相結(jié)合的反式作用因子的調(diào)控。鹽脅迫誘導(dǎo)基因分為兩類[40,41]:一類是在植物的抗性中起作用的蛋白質(zhì)基因,包括直接保護細胞免受水分脅迫傷害的功能蛋白(如LEA蛋白、水通道蛋白、離子通道蛋白等)基因;滲透調(diào)節(jié)因子(如脯氨酸、甜菜堿、一些糖類)的合成酶基因;以及毒性降解酶(如谷胱甘肽

可溶性環(huán)氧化物水解酶、超氧化物酶、過S轉(zhuǎn)移酶、

氧化氫酶、和抗壞血酸過氧化物酶等)基因。前面已對其有了詳盡的論述,在此不再贅述。另一類即是在信號傳導(dǎo)和基因表達過程中起調(diào)節(jié)作用的蛋白質(zhì)基因,主要包括傳遞信號和調(diào)控基因表達的轉(zhuǎn)錄因子的基因,感應(yīng)和轉(zhuǎn)導(dǎo)脅迫信號的基因有:MAP激酶、受體蛋白激酶、核糖體蛋白激酶和轉(zhuǎn)CDP激酶、

錄調(diào)控蛋白激酶等對應(yīng)基因,以及在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用的蛋白酶,如磷酸酯酶、磷脂酶C等基因;轉(zhuǎn)錄因子包括如bZIP、MYC、MYB和DREB轉(zhuǎn)錄因子等。3.1　轉(zhuǎn)錄因子

植物轉(zhuǎn)錄因子一般由DNA結(jié)合區(qū)、寡聚化位點、轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)和一個核定位信號(nuclearlocaliza2

[52]

和AT2activatedproteinkinase,MAPK激酶)

MEKK1(編碼mitogen2activatedproteinkinaseki2[53]

2種。對它們的研nasekinaseMAPKKK激酶)

[42]

tionsignal,NLS)這4個功能區(qū)組成。植物轉(zhuǎn)錄

因子的DNA結(jié)合區(qū)常見的有bZIP結(jié)構(gòu)域、鋅指結(jié)構(gòu)域、MADS結(jié)構(gòu)域、MYC結(jié)構(gòu)域,以及MYB結(jié)構(gòu)域等。相同類型的轉(zhuǎn)錄因子含有高度保守的氨基酸殘基、鋅指結(jié)構(gòu)域的bZIP結(jié)構(gòu)域的精氨酸殘基、半胱氨酸和組氨酸殘基等,這些氨基酸殘基專一性地與順式作用元件相互作用,由此決定蛋白的專一性[43,44]。寡聚化位點是不同轉(zhuǎn)錄因子借以發(fā)生相互作用的功能域,它們的氨基酸序列保守,與DNA結(jié)合區(qū)形成一定的空間構(gòu)象,如bZIP類轉(zhuǎn)錄因子的拉鏈結(jié)構(gòu),b??HLH類轉(zhuǎn)錄因子的螺旋2環(huán)2螺旋結(jié)構(gòu)等。核定位信號區(qū)(NLS)的轉(zhuǎn)錄因子中富含精氨酸和賴氨酸殘基的核定位區(qū)域,轉(zhuǎn)錄因子進入細胞核的過程受核區(qū)段控制[45]。目前已在多種轉(zhuǎn)錄因子中鑒定了多種NLS序列[46]。植物體內(nèi)存在大量的轉(zhuǎn)錄因子,僅擬南芥中就分離出30多種bZIP型轉(zhuǎn)錄

[47]

因子和40多種AP2??EREBP類轉(zhuǎn)錄因子。AP2??EREBP類轉(zhuǎn)錄因子都含有由60個左右的氨基酸殘基組成的非常保守的DNA結(jié)合區(qū)(即AP2??EREBP結(jié)構(gòu)域),且N2末端都有起核定位作用的堿性氨基酸序列[48]。AP2型轉(zhuǎn)錄因子含有2個AP2??

究表明,MAP激酶級聯(lián)系統(tǒng)不僅在蛋白質(zhì)水平上受到磷酸化和去磷酸化的調(diào)控,在轉(zhuǎn)錄水平上也受到環(huán)境脅迫信號的誘導(dǎo)調(diào)控。

在植物細胞中目前了解較多的是依賴Ca2+的蛋白激酶(calcium2dependenceproteinkinase,CDPKs)。Urao等從擬南芥中分離了兩個編碼CDPKs的cDNA克隆(cATCDPK1和cATCDPK2)[54]。Northernblot分析表明,在干旱和鹽脅迫下,這兩個基因的mRNA被迅速誘導(dǎo)。進一步的實驗證明,ATCDPK1蛋白通過激活一個逆境誘導(dǎo)的啟動子

HVA1傳遞鹽脅迫信號,且在轉(zhuǎn)導(dǎo)鹽脅迫信號中起

正調(diào)控作用[55]。轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白激酶基因是最近從擬南芥果實中分離出的一種新的蛋白激酶基因,它編碼的氨基酸序列與酵母dbf2基因編碼的氨基酸序列有很高的同源性,定名為At2dbf2,在擬南芥信號傳導(dǎo)中的功能尚不清楚。此外,在植物上存在的類受體蛋白激酶(receptor2likeproteinkinases,RLKs)、核糖體蛋白激酶基因與鹽脅迫有關(guān)。而磷脂酶C(phospholipaseC,PLC)啟動胞內(nèi)Ca2+信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。細胞內(nèi)Ca2+水平的提高能降低K+向內(nèi)通道的活性,促使氣孔關(guān)閉[56],誘導(dǎo)滲透脅迫應(yīng)答基因的表達[57]。如滲透脅迫能誘導(dǎo)擬南芥中編碼PLC的基因(AtPLC1)的表達[58],IP3含量增加[59]。

EREBP結(jié)構(gòu)域,調(diào)控細胞的生長發(fā)育;EREBP型轉(zhuǎn)

錄因子含有1個AP2??EREBP結(jié)構(gòu)域,調(diào)節(jié)植物對激素、病原、低溫、干旱及高鹽等的分子應(yīng)答。Shi2nozaki等從擬南芥中克隆了一批受干旱誘導(dǎo)的rd(responsivetodehydration)基因,其中一個受干旱同時也受高鹽、低溫誘導(dǎo)的rd29A基因的啟動子中有一個與逆境脅迫應(yīng)答相關(guān)的順式作用的元件DRE(dehydrationresponsiveelement)。DRE的核心序列為CCGAC。該核心序列普遍存在于干旱、高鹽或低溫脅迫應(yīng)答基因的啟動子中,對這些基因的逆境表達起調(diào)控作用[49]。3.2　信號傳導(dǎo)有關(guān)基因

已經(jīng)知道植物體感受外界逆境有兩種反映途徑:ABA依賴型和ABA非依賴型。而蛋白激酶是信號進一步傳導(dǎo)的重要組分,促分裂原活化蛋白激酶(MAP)家族的成員在多種信號傳遞系統(tǒng)中起著重要的作用,它們均為保守的絲氨酸??蘇氨酸類蛋白激酶。近年來,人們已從擬南芥、苜蓿(Medicago

煙草(Nicotinatabacum)等高等植物中分離sativa)、

出一系列促分裂原活化蛋白激酶家族的成員,它們分別在植物信號傳遞的不同過程中起作用[50,51]。從

擬南芥中分離到的被干旱、高鹽及低溫脅迫誘導(dǎo)的MAP蛋白激酶基因有ATMPK3(編碼mitogen2

4　植物鹽脅迫相應(yīng)基因的研究展望

盡管目前我們對植物鹽脅迫相應(yīng)的分子機制的研究取得了不少進展,但距離徹底搞清楚這一重大問題還有相當(dāng)長的路要走。近幾年我們對這方面的研究主要集中在:基礎(chǔ)分子生物學(xué)和脅迫條件下信號傳導(dǎo)的研究;在部分作物中克隆抗鹽相關(guān)基因以及這些基因的順反式作用因子對基因的調(diào)控作用。解除脅迫后,再水化相關(guān)基因目前研究不多。植物的抗鹽脅迫功能,從遺傳角度來看,是有多基因控制的綜合反應(yīng)。鹽脅迫條件可誘導(dǎo)植物表達多種基因,這些基因又產(chǎn)生多種功能各異的產(chǎn)物,這些產(chǎn)物不僅是植物對脅迫條件的反應(yīng),而且其中很多物質(zhì)與植物的抗脅迫密切相關(guān)。因此,通過基因工程使單功能基因在轉(zhuǎn)化植株中過量表達只能在一定程度上提高植株的抗逆性。

綜上所述,對分離的基因進行進一步的鑒定,以明確其在植物抗鹽脅迫方面的角色;植物對脅迫的

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鹽脅迫下植物基因的表達與基因工程研究進展[1]47