本文關(guān)鍵詞：里氏木霉銅代謝相關(guān)基因克隆與功能分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《上海交通大學(xué)》 2013年

里氏木霉銅代謝相關(guān)基因克隆與功能分析

傅科鶴  

【摘要】：木霉菌是土壤中普遍存在的習(xí)居菌，在植物病害生物防治和土壤農(nóng)化污染修復(fù)中具有廣泛的應(yīng)用。然而木霉菌在與銅制劑農(nóng)藥協(xié)同防治植物病害、與肥料復(fù)合使用提高作物產(chǎn)量及修復(fù)重金屬污染環(huán)境中，需要具備良好的銅耐受性或吸附性。因此，研究木霉銅代謝相關(guān)基因及其功能，揭示木霉菌耐受、吸附和轉(zhuǎn)運(yùn)銅的機(jī)理，為提高木霉菌在銅脅迫下的防病、修復(fù)環(huán)境效應(yīng)奠定理論基礎(chǔ)，對(duì)構(gòu)建高效吸附或高耐受銅的工程菌也具有重要意義。本研究以基因組已測(cè)序的里氏木霉（Trichoderma reesei）QM6a為原始菌，克隆銅代謝相關(guān)基因，并通過(guò)改進(jìn)的農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化技術(shù)（ATMT）構(gòu)建、篩選高吸附銅的里氏木霉突變株，克隆高吸附銅相關(guān)基因，在遺傳、生物化學(xué)和組學(xué)的尺度上明確其代謝功能和作用機(jī)制。主要的研究?jī)?nèi)容如下： 1.高吸附銅突變株的構(gòu)建與篩選 對(duì)常規(guī)的農(nóng)桿菌介導(dǎo)（ATMT）轉(zhuǎn)化方法進(jìn)行了改進(jìn)，建立了一種高效篩選吸附銅突變株的方法。通過(guò)該方法，構(gòu)建了1664株突變株，并從中篩選到一株高吸附銅突變株AT01，當(dāng)培養(yǎng)基銅濃度為0.7mM時(shí)，AT01銅吸附率達(dá)到12.73mg/g（96.1%），而野生株（WT）吸附率僅為5.97mg/g（49.6%）。顯微鏡觀察表明，AT01突變株胞內(nèi)液泡數(shù)量明顯多于WT，在銅脅迫下可富集較多的銅離子，胞內(nèi)多余的銅離子儲(chǔ)存在液泡中可減少銅對(duì)細(xì)胞的毒性作用，進(jìn)而提高木霉菌對(duì)銅的耐受能力。 2. Tad1基因克隆與功能分析 通過(guò)反向PCR擴(kuò)增獲得的T-DNA插入片段側(cè)翼序列并通過(guò)NCBI比對(duì)分析后獲得基因Tad1。分析表明，該基因讀碼框含1533bp堿基，無(wú)內(nèi)含子，在里氏木霉中為單拷貝，編碼一個(gè)510氨基酸的蛋白，屬于COG0420，為酰胺水解酶超家族成員。原核表達(dá)產(chǎn)物純化后，進(jìn)行酶活測(cè)定，結(jié)果表明：以腺嘌呤為底物時(shí)，酶活性最高，Km為0.66mM。RNA介導(dǎo)基因沉默和過(guò)表達(dá)分析表明：在1mM銅脅迫下，WT、AT01、過(guò)表達(dá)子(Ovex-Tad1)及沉默子（RNAi-Tad1）的銅吸附水平分別為7.5、14.1、12.3及4.9mg/g （P值為0.02，T-test）。在同濃度銅脅迫下，通過(guò)熒光定量PCR分析了RNAi-Tad1、Ovex-Tad1及AT01、WT中已知的酵母菌銅代謝相關(guān)基因的表達(dá)水平，結(jié)果表明：Trace、Trccs、Tratx、Trcox四個(gè)基因在Ovex-Tad1和AT01中均上調(diào)表達(dá)，而在RNAi-Tad1中，這些基因表達(dá)水平與野生株無(wú)明顯差異。進(jìn)一步通過(guò)HPLC分析WT、AT01、Ovex-Tad1、RNAi-Tad1中可與銅相結(jié)合的次黃嘌呤、黃嘌呤產(chǎn)生水平，發(fā)現(xiàn)與WT相比，Ovex-Tad1和AT01中兩種次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生均明顯增加，而RNAi-Tad1產(chǎn)量低于野生株。上述研究從遺傳和生化水平上說(shuō)明該基因參與里氏木霉對(duì)銅的吸附過(guò)程。 3. Tad1基因?qū)︺~代謝相關(guān)基因的調(diào)控作用 通過(guò)表達(dá)譜芯片技術(shù)分析了AT01與WT在1mM銅脅迫下基因表達(dá)水平的差異，共獲得624個(gè)上調(diào)基因，305個(gè)下調(diào)基因。根據(jù)NCBI對(duì)基因功能的分析，上調(diào)基因共分為22類。其中與銅代謝相關(guān)的基因主要有三類：（1）調(diào)控胞內(nèi)離子平衡的基因。如胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)，細(xì)胞器跨膜運(yùn)輸相關(guān)基因26個(gè)（4.2%），無(wú)機(jī)離子運(yùn)輸及代謝相關(guān)基因25個(gè)（4.0%）。（2）耐受和解除重金屬毒性作用的相關(guān)基因，如細(xì)胞解除重金屬毒性相關(guān)基因有11個(gè)（1.8%）；與細(xì)胞耐受脅迫反應(yīng)相關(guān)基因有11個(gè)（1.8%）；與細(xì)胞壁合成，細(xì)胞器的膜合成相關(guān)基因有8個(gè)（1.3%），這些基因可能參與銅的跨膜運(yùn)送。對(duì)這8個(gè)基因進(jìn)行了基因敲除，結(jié)果表明，其中一個(gè)基因被敲除后，菌體在銅脅迫下生長(zhǎng)受到抑制，而且銅的吸附能力也低于WT，該基因功能有待進(jìn)一步研究。（3）腺嘌呤脫氨酶功能及腺嘌呤代謝相關(guān)基因9個(gè)（1.4%）。為驗(yàn)證上述基因的表達(dá)水平，選擇了上述銅代謝及腺嘌呤代謝相關(guān)基因中差異最顯著的8個(gè)基因進(jìn)行RT-PCR分析：①鐵氧化酶蛋白（Fet3p），催化二個(gè)鐵氧化成三價(jià)鐵，1分子該酶需要4分子銅作為輔基。酵母菌研究表明，胞外銅離子濃度變化對(duì)該酶活性有明顯影響。②谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶，廣泛分布于生物體內(nèi)具多種功能的超家族酶，是真菌胞內(nèi)非常重要的銅解毒肽類物質(zhì)。主要催化谷胱甘肽（GSH）的結(jié)合反應(yīng)。③細(xì)胞色素C氧化酶，存在線粒體內(nèi)膜，是細(xì)胞呼吸鏈中非常關(guān)鍵的一個(gè)酶，在動(dòng)物細(xì)胞凋亡過(guò)程起重要作用。該酶催化功能需要銅離子作為輔基。④Cccs同源蛋白。Cccs蛋白是酵母細(xì)胞內(nèi)小分子多肽，主要功能是負(fù)責(zé)將胞內(nèi)銅離子運(yùn)送到SOD酶（超氧化物歧化酶）。與胞內(nèi)銅解毒功能密切相關(guān)。⑤Tctr2基因，編碼一個(gè)Ctr2同源基因，該基因在釀酒酵母中與亞銅離子液泡儲(chǔ)存相關(guān)。⑥尿囊素酶基因，該基因催化尿囊素轉(zhuǎn)變成尿囊酸，為腺嘌呤分解代謝下游關(guān)鍵酶。⑦磷酸核糖甲酰甘氨脒合酶屬于腺嘌呤代謝途徑中分支途徑中一個(gè)酶，催化磷酸核糖焦磷酸（PRPP）轉(zhuǎn)變?yōu)?`單磷酸鹽肌苷（IMP）。⑧GTP（三磷酸鳥苷）環(huán)水解酶，催化GTP水解為單磷酸黃苷，腺嘌呤代謝途徑中分支途徑中一個(gè)酶。結(jié)果表明,與野生株相比，這些基因在過(guò)表達(dá)子和AT01中表達(dá)水平都比野生株提高2倍以上。 4.胞內(nèi)銅轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因克隆及功能分析 首次在里氏木霉菌中克隆并驗(yàn)證6個(gè)銅代謝調(diào)控因子及功能基因：Tmac1、Trace、Tctr3、Trccs、Tratx、Trcox。其中Tmac1與釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Mac1蛋白同源，胞內(nèi)高親和銅轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控因子；Trace與酵母Ace1蛋白同源，控制胞內(nèi)金屬蛋白的表達(dá)，參與胞內(nèi)銅毒性的解毒；Tctr3與酵母跨膜蛋白Ctr3同源，參與銅的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)；Trccs與酵母Ccs1蛋白同源，特異性將銅轉(zhuǎn)運(yùn)到胞質(zhì)中的抗氧化酶SOD；Tratx與酵母Atx1蛋白同源，能夠與亞銅離子結(jié)合形成二聚體，將其傳遞給高爾基體；Trcox與酵母Cox17蛋白同源，通過(guò)兩個(gè)中間蛋白因子介導(dǎo)，將亞銅離子傳遞給細(xì)胞色素C氧化酶。進(jìn)一步研究表明Tmac1基因編碼一個(gè)501氨基酸的蛋白。在蛋白C端具兩個(gè)Cys-His重復(fù)序列結(jié)構(gòu)，與銅結(jié)合有關(guān)。敲除該基因后，木霉菌生長(zhǎng)緩慢且對(duì)銅饑餓敏感，基因回補(bǔ)后，功能得到完全恢復(fù)。將該基因回補(bǔ)到酵母突變株△Mac1能完全恢復(fù)酵母突變株耐受銅饑餓能力。Trace基因編碼一個(gè)含405氨基酸的蛋白，蛋白含4個(gè)CXXC結(jié)構(gòu)域，與銅結(jié)合有關(guān)。同時(shí)在蛋白N端含銅依賴型DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域CVRGHR。酵母回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)表明，該基因能夠完全恢復(fù)酵母△Ace1的功能。Tctr3蛋白含178個(gè)氨基酸，具有3個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，N端含保守結(jié)構(gòu)域MLLAM。Trccs、Tratx、Trcox分別編碼三個(gè)小分子銅分子伴侶。Trccs編碼248個(gè)氨基酸的蛋白，N端含保守結(jié)構(gòu)域CXXCV，與銅結(jié)合功能相關(guān)酵母胞內(nèi)銅相關(guān)分子伴侶同源。Tratx編碼一條含82氨基酸的蛋白，N端具有保守結(jié)構(gòu)域MTCXXC。Trcox編碼61個(gè)氨基酸的蛋白。另外，Trace、Trccs、Tratx、Trcox這四個(gè)基因的表達(dá)水平變化可用于監(jiān)測(cè)細(xì)胞內(nèi)銅離子濃度的變化。 綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果提出Tad1基因參與木霉菌銅吸附和胞內(nèi)銅代謝可能途徑為：腺嘌呤脫氨酶（Tad1基因編碼）催化木霉胞內(nèi)腺嘌呤代謝途徑中的次黃嘌呤及黃嘌呤合成，而這兩種物質(zhì)與胞內(nèi)銅離子結(jié)合，導(dǎo)致細(xì)胞銅離子濃度低于正常水平。胞內(nèi)自由銅離子濃度的微小改變激活了細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，引起細(xì)胞泵入銅離子，而導(dǎo)致胞內(nèi)銅離子濃度升高。銅濃度的升高，激活胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子Trace，調(diào)控胞內(nèi)金屬硫蛋白表達(dá)；同時(shí)，，胞內(nèi)銅相關(guān)分子伴侶Trccs、Tratx、Trcox表達(dá)上調(diào)，負(fù)責(zé)將胞內(nèi)多余的銅離子轉(zhuǎn)運(yùn)到不同細(xì)胞器，解除胞內(nèi)過(guò)量銅引起的細(xì)胞毒性。

【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：Q78
【目錄】：

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  本文關(guān)鍵詞：里氏木霉銅代謝相關(guān)基因克隆與功能分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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