本文關鍵詞：農(nóng)桿菌介導玉米愈傷遺傳轉化體系優(yōu)化及基因工程雄性不育系初步研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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博士論文    

農(nóng)桿菌介導玉米愈傷遺傳轉化體系優(yōu)化及基因工程雄性不育系初步研究

     論文目錄

英文縮寫與中英文擴展名第1-10頁

中文摘要第10-12頁

ABSTRACT第12-14頁

第一部分 文獻綜述第14-45頁

 1 玉米遺傳轉化研究綜述第14-27頁

   ·植物遺傳轉化的方法、原理及優(yōu)缺點第14-19頁

     ·基因槍轉化法第14-15頁

     ·農(nóng)桿菌介導法第15-17頁

     ·花粉管通道法第17-18頁

     ·聚乙二醇介導法第18頁

     ·電擊法第18-19頁

     ·脂質體介導法第19頁

   ·農(nóng)桿菌介導的玉米遺傳轉化的研究歷程第19-22頁

   ·影響玉米遺傳轉化的一些關鍵因素第22-27頁

     ·玉米遺傳轉化中不同受體再生體系的建立第22-24頁

       ·不同受體材料對玉米再生的影響第22-23頁

       ·基因型對玉米體細胞再生能力的影響第23頁

       ·培養(yǎng)條件對玉米體細胞再生能力的影響第23-24頁

     ·受體材料、生長狀況及基因型對遺傳轉化的影響第24頁

     ·不同的培養(yǎng)基成分對玉米遺傳轉化的影響第24-26頁

       ·基本培養(yǎng)基對玉米遺傳轉化的影響第24-25頁

       ·培養(yǎng)基中附加其它物質對玉米遺傳轉化的影響第25-26頁

     ·農(nóng)桿菌菌株及載體對遺傳轉化的影響第26頁

     ·選擇性標記基因對遺傳轉化的影響第26-27頁

     ·其它因素的影響第27頁

 2 植物啟動子研究概況第27-33頁

   ·高等植物啟動子的分類和結構第27-30頁

     ·高等植物啟動子的類別第27-29頁

       ·組成型啟動子第28頁

       ·組織或器官特異性啟動子第28頁

       ·誘導型啟動子第28-29頁

     ·高等植物啟動子的結構特征第29-30頁

       ·轉錄起始位點第29頁

       ·TATA-box第29-30頁

       ·CAAT-box第30頁

       ·G-box第30頁

       ·增強子和沉默子第30頁

   ·煙草中與花發(fā)育有關啟動子的研究現(xiàn)狀第30-32頁

     ·煙草花藥特異表達啟動子第31頁

     ·煙草花粉特異表達啟動子第31-32頁

   ·Zm13基因啟動子的研究現(xiàn)狀第32頁

   ·啟動子研究與作物雄性不育第32-33頁

 3 基因工程創(chuàng)建雄性不育系研究概況第33-45頁

   ·植物雄性不育(male sterility)的類型及遺傳機制第33-36頁

     ·細胞核不育型(GMS)第34頁

       ·隱性核不育第34頁

       ·顯性核不育第34頁

     ·細胞質雄性不育型(CMS)第34-36頁

       ·孢子體細胞質雄性不育第35頁

       ·配子體細胞質雄性不育第35-36頁

   ·基因工程創(chuàng)建雄性不育系的研究進展第36-41頁

     ·破壞花粉或花藥的正常發(fā)育創(chuàng)造雄性不育性狀第36-39頁

       ·Mariani雄性不育系統(tǒng)(barnase／barstar—bar系統(tǒng))第37-38頁

       ·通過提早降解胼胝質獲得植物雄性不育系第38-39頁

       ·噴施外源物質誘導產(chǎn)生植物雄性不育第39頁

       ·通過其它細胞毒素創(chuàng)建雄性不育第39頁

     ·利用反義基因技術創(chuàng)造雄性不育性狀第39-40頁

     ·通過共抑制創(chuàng)造雄性不育第40-41頁

     ·通過細菌影響小孢子發(fā)育引起雄性不育第41頁

   ·argE基因及其應用研究進展第41-45頁

第二部分 研究內容第45-113頁

 第一章 農(nóng)桿菌介導的玉米胚性愈傷的遺傳轉化研究第45-73頁

  第一節(jié) 本研究的目的、意義及內容第45-46頁

   1 本研究的背景、目的及意義第45-46頁

   2 研究內容第46頁

  第二節(jié) 材料與方法第46-54頁

   1 實驗材料第46-49頁

   ·供試玉米材料第46頁

   ·菌株及質粒第46-47頁

   ·重要試劑、耗材及其它材料第47頁

   ·各種培養(yǎng)基及成分第47-49頁

     ·玉米培養(yǎng)基母液配方第47-48頁

     ·玉米愈傷誘導及后期培養(yǎng)培養(yǎng)基成分第48頁

     ·玉米愈傷侵染過程所用培養(yǎng)基成分第48-49頁

   2 實驗方法第49-54頁

   ·農(nóng)桿菌菌株的準備第49頁

   ·玉米胚性愈傷的獲得及農(nóng)桿菌介導的遺傳轉化第49-51頁

     ·玉米胚性愈傷的誘導及繼代培養(yǎng)第49-50頁

     ·農(nóng)桿菌介導的遺傳轉化流程第50-51頁

       ·農(nóng)桿菌侵染液的準備第50頁

       ·愈傷侵染第50頁

       ·抗性愈傷的篩選及再生第50-51頁

   ·玉米愈傷及轉基因植株葉片的GUS表達分析第51-52頁

     ·GUS染色液的配制第51-52頁

     ·愈傷GUS瞬時表達率分析第52頁

     ·轉基因植株葉片GUS染色第52頁

   ·玉米抗性愈傷率分析第52頁

   ·轉基因植株的分子檢測第52-53頁

     ·玉米葉片DNA微量提取法第52-53頁

     ·抗性植株的PCR檢測第53頁

   ·玉米胚性愈傷對潮霉素抗性臨界濃度的決定第53-54頁

  第三節(jié) 結果與分析第54-66頁

   1 玉米胚性愈傷對潮霉素抗性臨界濃度的決定第54-55頁

   2 不同菌株及愈傷材料對玉米愈傷遺傳轉化效率的影響第55-57頁

   3 不同侵染時間對玉米愈傷遺傳轉化效率的影響第57-58頁

   4 不同菌液(侵染液)濃度對玉米愈傷遺傳轉化效率的影響第58-59頁

   5 侵染液中不同濃度Tween 20對玉米愈傷遺傳轉化效率的影響第59-60頁

   6 不同共培養(yǎng)溫度對玉米愈傷遺傳轉化效率的影響第60-61頁

   7 不同共培養(yǎng)pH值對玉米愈傷遺傳轉化的影響第61-62頁

   8 共培養(yǎng)基中不同濃度乙酰丁香酮對玉米愈傷遺傳轉化效率影響第62-63頁

   9 共培養(yǎng)基中不同濃度L—半胱氨酸對玉米愈傷遺傳轉化效率的影響第63-64頁

   10 共培養(yǎng)基中不同濃度二硫基蘇糖醇對玉米愈傷遺傳轉化效率的影響第64-65頁

   11 T_0代轉基因植株的PCR檢測及葉片的GUS表達分析第65-66頁

  第四節(jié) 討論第66-72頁

   1 潮霉素篩選濃度對轉基因愈傷存活率的影響第66頁

   2 農(nóng)桿菌菌株類型對遺傳轉化的影響第66-67頁

   3 農(nóng)桿菌的生長狀態(tài)對遺傳轉化的影響第67-68頁

   4 農(nóng)桿菌侵染液濃度和侵染時間對愈傷轉化的影響第68頁

   5 共培養(yǎng)環(huán)境對遺傳轉化的影響第68-70頁

   ·pH值第69頁

   ·溫度第69-70頁

   6 表面活性劑和抗氧化劑在愈傷遺傳轉化中的作用第70-71頁

   7 玉米遺傳轉化過程中陽性轉化細胞和再生植株的一致性第71-72頁

  第五節(jié) 小結第72-73頁

 第二章 玉米花粉特異表達啟動子Zm13的分離及功能鑒定、煙草花粉特異表達啟動子序列NTPp13的分離、結構特征及時空表達分析第73-101頁

  第一節(jié) 本研究背景、目的意義及技術路線第73-76頁

   1 本研究背景第73-74頁

   2 本研究目的及意義第74-75頁

   ·對Zm13啟動子活性檢測第74頁

   ·對野生型煙草中NTPp13序列的功能鑒定第74-75頁

   3 本研究的技術路線第75-76頁

  第二節(jié) 材料與方法第76-91頁

   1 實驗材料第76-77頁

   ·植物材料第76頁

   ·菌株及質粒第76頁

   ·重要試劑、耗材及其它材料第76頁

   ·培養(yǎng)基及成分第76-77頁

   2 實驗辦法第77-91頁

   ·玉米花粉特異表達啟動子Zm13及煙草特異表達片段NTPp13的獲得第77-78頁

     ·玉米葉片和煙草葉片DNA微量提取法第77頁

     ·玉米中Zm13啟動子及煙草中NTPp13片段的PCR擴增第77-78頁

   ·玉米啟動子Zm13及煙草啟動子片段NTPp13表達載體構建第78-83頁

     ·PCR產(chǎn)物回收與純化第78-79頁

     ·目的片段與T載體連接第79頁

     ·CaCl_2法制備大腸桿菌DH5α感受態(tài)第79-80頁

     ·藍白斑篩選平板的制備第80頁

     ·熱激轉化法將質粒轉入大腸桿菌第80頁

     ·轉化子的鑒定第80頁

     ·細菌培養(yǎng)、收集以及堿裂解法提取質粒DNA第80-81頁

     ·聚乙二醇法沉淀純化質粒DNA第81-82頁

     ·質粒及載體的酶切第82-83頁

     ·Zm13及NTPp13片段與載體pBI121連接第83頁

     ·熱激法將質粒載體轉入大腸桿菌DH5α感受態(tài)以及轉化子的鑒定第83頁

     ·三親交配法將表達載體pBI121—Zm13(或NTPp13)導入農(nóng)桿菌第83頁

   ·農(nóng)桿菌介導的葉盤轉化法轉化煙草第83-84頁

   ·轉基因煙草繼代及移栽第84頁

   ·轉Zm13啟動子煙草植株的PCR檢測及Zm13啟動子活性鑒定第84-85頁

     ·轉Zm13啟動子煙草葉片DNA微量提取法及GUS染色液的配制第84頁

     ·轉Zm13啟動子抗性煙草植株的PCR檢測第84-85頁

     ·Zm13啟動子的活性鑒定第85頁

   ·轉NTPp13-GUS煙草植株的分子檢測第85-90頁

     ·轉NTPp13-GUS抗性煙草植株的PCR檢測第85頁

     ·轉NTPp13-GUS煙草植株的PCR—Southern檢測第85-90頁

       ·探針DNA序列的獲得第85頁

       ·轉基因煙草植株的PCR—Southern檢測第85-90頁

   ·NTPp13片段的啟動子活性驗證及時空特異表達第90-91頁

     ·NTPp13片段在煙草花藥中的活性驗證第90頁

     ·NTPp13片段的特異表達部位鑒定第90頁

     ·不同花期NTPp13—GUS表達量分析第90-91頁

     ·NTPp13片段啟動子活性對溫度影響的穩(wěn)定性分析第91頁

     ·GUS活性熒光定量方法第91頁

  第三節(jié) 結果與分析第91-98頁

   1 玉米花粉特異表達啟動子Zm13的分離及活性鑒定第91-94頁

   ·Zm13啟動子的分離第91-92頁

   ·Zm13啟動子活性鑒定第92-94頁

   2 煙草花粉特異表達序列NTPp13的結構和功能分析第94-98頁

   ·NTPp13序列的結構分析第94-95頁

   ·轉NTPp13-GUS煙草植株的分子檢測第95-96頁

   ·NTPp13序列的啟動子活性驗證及時空特異表達第96-98頁

   ·NTPp13啟動子片段對溫度改變的穩(wěn)定性分析第98頁

  第四節(jié) 討論第98-100頁

   1 玉米花粉特異表達啟動子Zm13在創(chuàng)建雄性不育系中的應用第98-99頁

   2 對NTPp13啟動子序列的研究及意義第99-100頁

  第五節(jié) 小結第100-101頁

 第三章 基因工程創(chuàng)建玉米雄性不育系的初步研究第101-113頁

  第一節(jié) 本研究目的、意義及技術路線第101頁

   1 本研究目的及意義第101頁

   2 本研究的技術路線第101頁

  第二節(jié) 材料與方法第101-107頁

   1 實驗材料第101-104頁

   ·植物材料第101-102頁

   ·菌株及質粒第102頁

   ·重要試劑、耗材及其它材料第102頁

   ·培養(yǎng)基及成分第102-104頁

   2 實驗方法第104-107頁

   ·脫乙酰酶基因argE的獲得第104-105頁

     ·大腸桿菌菌株基因組的提取第104頁

     ·argE基因的獲得第104-105頁

   ·玉米花粉特異表達啟動子Zm13的獲得第105頁

   ·玉米表達載體p1300-Zm13-argE的構建第105-106頁

   ·玉米幼胚及胚性愈傷的遺傳轉化第106頁

     ·農(nóng)桿菌介導的玉米愈傷的遺傳轉化第106頁

     ·農(nóng)桿菌介導的幼胚的遺傳轉化第106頁

   ·轉基因植株的分子檢測第106-107頁

     ·抗性植株的PCR檢測第106-107頁

     ·PCR陽性植株的PCR-Southern檢測第107頁

       ·雜交探針的獲得第107頁

       ·PCR-Southern雜交過程第107頁

  第三節(jié) 結果與分析第107-110頁

   1 脫乙酰酶基因argE的獲得第107-108頁

   2 玉米表達載體p1300-Zm13-argE的構建第108頁

   3 農(nóng)桿菌介導的玉米愈傷的遺傳轉化第108-109頁

   4 轉基因植株的分子檢測第109-110頁

  第四節(jié) 討論第110-112頁

   1 通過花粉特異啟動子創(chuàng)建雄性不育系第110-111頁

   2 通過外施N-乙酰-草丁膦誘導轉argE基因植株雄性不育系策略的優(yōu)缺點第111-112頁

  第五節(jié) 小結第112-113頁

參考文獻第113-125頁

致謝第125-126頁

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