本文關(guān)鍵詞：辣椒水通道蛋白基因家族分析及CaTIP1-1和CaPIP1-1功能研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《西北農(nóng)林科技大學(xué)》 2014年

辣椒水通道蛋白基因家族分析及CaTIP1-1和CaPIP1-1功能研究

尹延旭  

【摘要】：辣椒（Capsicum annuum L.）在亞熱帶和溫帶廣泛栽培，是重要的風(fēng)味蔬菜。目前，聯(lián)合國糧農(nóng)組織數(shù)據(jù)顯示辣椒的需求在不斷地增加。然而，辣椒在各地栽培中普遍受到生物和非生物脅迫的危害而減產(chǎn)，目前人們通過育種和栽培措施來提高辣椒對脅迫的抗性。但是，辣椒轉(zhuǎn)基因工作開展以來，由于受到辣椒再生效率差、轉(zhuǎn)化效率低和抗性基因挖掘不足的影響，進(jìn)展緩慢。因此候選抗性資源和生物技術(shù)輔助育種成為我們研究的重點(diǎn)。實驗室前期通過差異顯示文庫篩選到液泡膜水通道蛋白基因CaTIP1-1（tonoplastintrinsic protein gene1-1in pepper），本研究利用超量表達(dá)技術(shù)分析其在低溫、滲透脅迫中的功能及作用機(jī)理。結(jié)合辣椒疫霉菌侵染處理轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)庫、外源脫落酸處理后辣椒低溫脅迫消減雜交文庫和韓國抗寒表達(dá)序列標(biāo)簽數(shù)據(jù)庫，候選到辣椒質(zhì)膜內(nèi)在水通道蛋白基因CaPIP1-1（plasma membrane intrinsic protein gene1-1in pepper），利用病毒誘導(dǎo)基因沉默技術(shù)分析其在滲透脅迫中的功能。2014年辣椒栽培種遵辣和野生種CM334測序完成、公布，候選抗逆基因變得更加現(xiàn)實。本試驗利用生物信息學(xué)知識對辣椒水通道蛋白全基因組特征進(jìn)行分析，為辣椒水通道蛋白基因家族研究奠定基礎(chǔ)。同時，為研究水通道蛋白基因在辣椒中的功能，本試驗優(yōu)化了辣椒再生體系。主要研究結(jié)果如下： 1.以膜內(nèi)在蛋白的種子序列PF00230為基礎(chǔ)，利用HMMER3.0軟件在辣椒蛋白數(shù)據(jù)庫中檢索，CM334中檢索到61條候選序列（V1.55），檢索到的候選序列在染色體上能夠定位的是56個水通道蛋白基因（aquaporins，AQPs）。這些AQPs在各染色體分布由多到少順序為Chr01（11）、Chr06（9）、Chr03（6）、Chr11（6）、Chr02（5）、Chr08（5）、Chr10（5）、Chr04（3）、Chr09（2）、Chr12（2）、Chr05（1）、Chr07（1）�；蚪Y(jié)構(gòu)分析表明，這些水通道蛋白具有0（CaPIP2-7、CaTIP1-11、CaTIP1-12、CaTIP1-13、CaTIP1-16和CaSIP2-1）到4個內(nèi)含子（CaNIP1-1、CaNIP3-1、CaNIP3-2、CaNIP4-2和CaNIP6-1）不等，內(nèi)含子剪切模式為（GT/AG）或（CT/AC），在同一基因內(nèi)，剪切方式一致。進(jìn)化樹構(gòu)建結(jié)果表明辣椒AQPs細(xì)分為5類：液泡膜蛋白亞家族（TIPs，23）、質(zhì)膜內(nèi)在蛋白亞家族（PIPs，15）、類根瘤菌26蛋白（NIPs，10）、小堿基內(nèi)在蛋白（SIP，3）和未知內(nèi)在蛋白（XIPs，2）。通過結(jié)構(gòu)預(yù)測，有41個辣椒水通道蛋白具有兩個完整的天冬氨酸-脯氨酸-丙氨酸(Asn-Pro-Ala，NPA)保守基序（或者類似NPA基序）。 2.對根、莖、葉和果實發(fā)育、成熟過程中24個組織水通道蛋白基因RNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，有27個水通道蛋白基因（21個在分類中，其他6個在V1.5版本中）參與果實的發(fā)育和成熟過程。這些基因表達(dá)如下：辣椒水通道蛋白CaSIP1-2、 CaTIP1-1在辣椒CM334和ECW30R各組織中表達(dá)量都比較高。CaPIP2-9在辣椒CM334和ECW30R果實轉(zhuǎn)色期后期（轉(zhuǎn)色10d，CMPLB10，ECPLB10）的胎座中表達(dá)量相對降低，在CM334果實轉(zhuǎn)色期后期（轉(zhuǎn)色10d）的果皮中（CMPCB10）表達(dá)量也相對降低，在其他組織中表達(dá)量都比較高。表達(dá)豐度低或者基本不表達(dá)的基因有CaNIP7-1、CaNIP4-1、CaNIP3-1、CaNIP1-3、CaNIP4-3、CaNIP3-2、CaPIP1-5、CaTIP1-13、CaTIP1-10、 CA04g3870和CA00g98340，其他基因受果實發(fā)育或成熟誘導(dǎo)表達(dá)�；駽aNIP4-1、CaNIP7-1、CaNIP6-1、CaTIP3-1、CA10g07870、CA00g57100和CaTIP1-1（ECW30R中上調(diào)）在授粉后不同天數(shù)的辣椒果皮和胎座中上調(diào)表達(dá)�；駽aSIP1-2，CaPIP1-4、CaNIP4-2、CaPIP2-5、CaPIP2-8、CaPIP2-9、CaTIP1-1、CaTIP3-2、CaNIP5-1和CA08g13100在授粉后不同天數(shù)的辣椒果皮和胎座中下調(diào)表達(dá)。果實轉(zhuǎn)色后上調(diào)基因為CaNIP1-1、CaNIP3-1、CaTIP3-1和CA00g98340，果實轉(zhuǎn)色后下調(diào)基因為CaNIP1-3、CaNIP6-1、CaTIP1-1、CaPIP2-8和CaPIP2-9。 3.辣椒水通道蛋白CaTIP1-1有1個內(nèi)含子，大小為1664bp，，內(nèi)含子剪切方式是GT/AG，定位于液泡。該基因在花、果、種子中表達(dá)高于根、莖、葉。該基因受50μM升汞、低溫和100μM氟啶酮下調(diào)表達(dá)，而受0.15M NaCl、0.15M甘露醇、5mM水楊酸和100μM脫落酸上調(diào)表達(dá)。病毒誘導(dǎo)該基因沉默后，植株表現(xiàn)矮化。 4.超量表達(dá)CaTIP1-1后，轉(zhuǎn)基因煙草受連續(xù)低溫脅迫后，恢復(fù)緩慢。轉(zhuǎn)基因煙草氣孔開張度明顯大于非轉(zhuǎn)基因煙草，大約86.3%的轉(zhuǎn)基因煙草氣孔寬長比處于0.31±0.047。非轉(zhuǎn)基因煙草的光合速率在低夜溫處理3d后抑制率達(dá)到45.29%，轉(zhuǎn)入恢復(fù)階段，非轉(zhuǎn)基因材料恢復(fù)光合能力很快，大概1d后，其光合速率就達(dá)到或超過正常水平。轉(zhuǎn)基因煙草在該處理后恢復(fù)較慢，胞間CO2濃度（Ci）高、光合速率較低。超量表達(dá)CaTIP1-1后，增強(qiáng)了細(xì)胞的活力、增加了活性氧清除相關(guān)酶活性和基因表達(dá)、提高了轉(zhuǎn)基因煙草對鹽脅迫和甘露醇脅迫的抗性。 5.辣椒質(zhì)膜內(nèi)在蛋白CaPIP1-1定位在質(zhì)膜和其他亞細(xì)胞器，與番茄、馬鈴薯同一亞家族基因都含有3個內(nèi)含子。該基因內(nèi)含子剪切方式為CT/AC。該基因在果實中表達(dá)量最高，受升汞和氟啶酮抑制，受低溫、鹽、甘露醇、脫落酸和辣椒疫霉菌侵染上調(diào)表達(dá)。病毒誘導(dǎo)該基因沉默后，辣椒植株矮化，離體葉圓片對鹽和甘露醇脅迫的抗性降低。 6.培養(yǎng)基GM3適合作為辣椒無菌苗生長的培養(yǎng)基。辣椒芽分化中，DM3和DM8適合B12芽分化、DM2適合HW203B芽分化、DM2和DM3適合CK7芽分化。在芽分化14-21d后，及時分離芽到伸長培養(yǎng)基上，能夠提高辣椒芽的伸長率。

【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：S641.3
【目錄】：

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5 何榮環(huán);水通道蛋白在人子宮內(nèi)膜中的表達(dá)及其調(diào)節(jié)機(jī)制的研究[D];浙江大學(xué);2006年

6 石向群;水通道蛋白4在缺血性腦水腫中的作用機(jī)制研究[D];蘇州大學(xué);2003年

7 張剛;水通道蛋白1、3在小鼠前列腺中的表達(dá)及意義[D];吉林大學(xué);2011年

8 王勇;血管活性藥物對膽道梗阻—再通術(shù)后腎水通道蛋白表達(dá)影響的實驗研究[D];中國醫(yī)科大學(xué);2006年

9 馮學(xué)超;水通道蛋白基因功能研究[D];東北師范大學(xué);2005年

10 王芳;甘草質(zhì)膜水通道蛋白GuPIP1的分子克隆、定位和表達(dá)調(diào)控[D];東北師范大學(xué);2006年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 康翠琴;水通道蛋白在人和小鼠喉組織中的表達(dá)[D];東北師范大學(xué);2009年

2 李艷;水通道蛋白1，4在正常大鼠角膜和晶體生長發(fā)育過程中的表達(dá)[D];蘭州大學(xué);2008年

3 金梅;水通道蛋白在消化系統(tǒng)的表達(dá)及其功能研究[D];吉林大學(xué);2006年

4 李昌慶;細(xì)菌水通道蛋白及其生理功能探討[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2007年

5 陳渙;中藥止瀉液對鼠輪狀病毒腸炎腸道水通道蛋白影響的研究[D];廣州醫(yī)學(xué)院;2009年

6 曾江;“治傷散”巴布劑干預(yù)大鼠創(chuàng)傷性模型中水通道蛋白-1表達(dá)的實驗研究[D];湖南中醫(yī)藥大學(xué);2009年

7 王晟;膽道梗阻—再通術(shù)后腎水通道蛋白1表達(dá)變化的實驗研究[D];中國醫(yī)科大學(xué);2006年

8 王文娟;水通道蛋白阻斷劑高通量篩選測定方法研究[D];東北師范大學(xué);2009年

9 李云飛;膽道梗阻—再通術(shù)后腎水通道蛋白3表達(dá)變化的實驗研究[D];中國醫(yī)科大學(xué);2006年

10 連珠蘭;內(nèi)毒素血癥對大鼠肺腎功能及水通道蛋白表達(dá)的影響[D];福建醫(yī)科大學(xué);2014年

  本文關(guān)鍵詞：辣椒水通道蛋白基因家族分析及CaTIP1-1和CaPIP1-1功能研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：65691