發(fā)布時間：2017-07-31 15:20

  本文關(guān)鍵詞：蘋果樹腐爛病菌三個果膠酶基因的致病功能研究

  更多相關(guān)文章： 蘋果樹腐爛病菌 果膠酶 多聚半乳糖醛酸酶 果膠裂解酶 致病力

【摘要】：蘋果樹腐爛病是由子囊菌門黑腐皮殼屬真菌Valsa mali引起的一種嚴(yán)重的枝干皮層腐爛病害,在我國發(fā)病普遍,嚴(yán)重影響了蘋果的產(chǎn)量和品質(zhì)。由于病菌的致病機理尚不完全明確,給腐爛病的預(yù)防和治理帶來了一定困難,探明蘋果樹腐爛病菌的致病機理,可為病害防治提供理論依據(jù)。蘋果樹腐爛病菌轉(zhuǎn)錄組結(jié)果分析表明有三個果膠酶基因在病菌侵染過程中上調(diào)表達倍數(shù)最高,分別為多聚半乳糖醛酸酶(Polygalacturonase,PG)基因Vmpg7、Vmpg8和果膠裂解酶(Pectate Lyase,PL)基因Vmpl4,明確這三個果膠酶基因在病菌致病過程中的作用,可進一步探究V.mali的致病機理。利用qRT-PCR檢測這三個果膠酶基因在病菌侵染定殖過程中的表達水平及基因敲除后同家族內(nèi)其它基因的表達水平。通過Double-joint PCR構(gòu)建基因敲除載體并利用PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術(shù)進行基因單敲除及雙敲除,經(jīng)PCR檢測及Southern Blot驗證確定基因敲除突變體,通過gap-repair技術(shù)對基因進行回復(fù)。將各突變體接種到PDA培養(yǎng)基上觀察突變體的營養(yǎng)生長;通過3,5-二硝基水楊酸(DNS)比色法檢測各突變體胞外果膠酶活力;離體接種富士蘋果葉片及枝條檢測基因?qū)χ虏×Φ挠绊?接種到果膠培養(yǎng)基上,觀察對果膠的利用。具體研究結(jié)果如下:1、與野生型菌株03-8菌絲相比,多聚半乳糖醛酸酶基因Vmpg7、Vmpg8和果膠裂解酶基因Vmpl4在病菌侵染定殖過程中分別上調(diào)表達27.73倍、8.19倍、10.20倍。2、通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化及驗證,分別獲得Vmpg7、Vmpg8和Vmpl4單敲除突變體各3個、1個、1個,Vmpg7/Vmpg8雙敲除突變體3個,并通過gap-repair技術(shù)獲得Vmpg7、Vmpg8基因回復(fù)突變體各1個。3、觀察各突變體在PDA培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)及大小,發(fā)現(xiàn)Vmpg7、Vmpg8和Vmpl4不影響病菌的營養(yǎng)生長;與03-8相比,Vmpg8單敲除及Vmpg7/Vmpg8雙敲除突變體胞外果膠酶活力顯著降低,分別降低44.40%和33.55%,Vmpg7、Vmpl4敲除突變體果膠酶活力與03-8差異不顯著;致病力結(jié)果表明,△Vmpg7-249、△Vmpl4-50和△Vmpg7/Vmpg8-119在葉片和枝條上的致病力與03-8相比均顯著降低,△Vmpg7-249在葉片和枝條上的致病力分別降低16.97%和8.70%,△Vmpl4-50在葉片和枝條上的致病力分別降低16.82%和18.59%,△Vmpg7/Vmpg8-119在葉片和枝條上的致病力分別降低13.12%和14.27%,△Vmpg8-82在葉片上致病力降低9.26%,而在枝條上與03-8差異不顯著。Vmpg7、Vmpg8、Vmpl4和Vmpg7/Vmpg8敲除突變體在果膠培養(yǎng)基上的生長3 d的菌落大小均小于03-8,分別減小9.58%、14.01%、8.79%和10.42%。Vmpg7和Vmpg8的基因回復(fù)突變體致病力、胞外果膠酶活力及在果膠培養(yǎng)基上的生長速率均回復(fù)到03-8水平。4、Vmpg7/Vmpg8雙敲除后PG家族內(nèi)有3個基因顯著上調(diào)表達,Vmpl4敲除后PL家族內(nèi)有4個基因上調(diào)表達明顯。綜上所述,多聚半乳糖醛酸酶基因Vmpg7、Vmpg8和果膠裂解酶基因Vmpl4通過降解果膠參與蘋果樹腐爛病菌V.mali的致病過程,目的基因敲除引起了同家族內(nèi)其它基因的表達量變化,家族內(nèi)其它基因可能在病菌致病過程中與其協(xié)同作用。
【關(guān)鍵詞】：蘋果樹腐爛病菌 果膠酶 多聚半乳糖醛酸酶 果膠裂解酶 致病力
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S436.611.11
【目錄】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-13
• 第一章 文獻綜述13-20
• 1.1 蘋果樹腐爛病研究概況13-15
• 1.1.1 蘋果樹腐爛病發(fā)生及危害13
• 1.1.2 蘋果樹腐爛病的發(fā)病癥狀13-14
• 1.1.3 蘋果樹腐爛病病原菌14
• 1.1.4 蘋果樹腐爛病菌的致病機理14
• 1.1.5 蘋果樹腐爛病的防治14-15
• 1.2 植物病原真菌細胞壁降解酶的研究15-16
• 1.2.1 細胞壁降解酶的分類15
• 1.2.2 細胞壁降解酶在真菌致病過程中的作用15-16
• 1.3 果膠酶研究現(xiàn)狀16-17
• 1.3.1 果膠酶分類16
• 1.3.2 果膠酶在致病過程中的作用16-17
• 1.4 多聚半乳糖醛酸酶研究現(xiàn)狀17-18
• 1.4.1 多聚半乳糖醛酸酶作用方式17
• 1.4.2 真菌多聚半乳糖醛酸酶的序列特征17
• 1.4.3 真菌多聚半乳糖醛酸酶的表達調(diào)控17-18
• 1.4.4 多聚半乳糖醛酸酶基因在真菌中的研究18
• 1.5 果膠裂解酶研究現(xiàn)狀18-19
• 1.5.1 果膠裂解酶作用方式18
• 1.5.2 果膠裂解酶的理化性質(zhì)18
• 1.5.3 果膠裂解酶基因在細菌中的研究18-19
• 1.5.4 果膠裂解酶基因在真菌中的研究19
• 1.6 研究目的及意義19-20
• 第二章 基因在菌絲和互作過程中差異表達分析20-24
• 2.1 材料、儀器與試劑20
• 2.1.1 材料20
• 2.1.2 儀器20
• 2.1.3 試劑20
• 2.2 試驗方法20-22
• 2.2.1 接種取樣20
• 2.2.2 總RNA提取20-21
• 2.2.3 cDNA第一鏈合成21
• 2.2.4 q RT-PCR驗證基因表達量21-22
• 2.3 結(jié)果與分析22
• 2.4 結(jié)論與討論22-24
• 第三章 基因敲除與回復(fù)24-40
• 3.1 材料、儀器與試劑24-25
• 3.1.1 材料24
• 3.1.2 儀器24
• 3.1.3 試劑24-25
• 3.2 試驗方法25-36
• 3.2.1 基因單敲除載體構(gòu)建25-29
• 3.2.2 原生質(zhì)體制備與轉(zhuǎn)化29
• 3.2.3 潮霉素初篩29-30
• 3.2.4 轉(zhuǎn)化子DNA快速提取30
• 3.2.5 轉(zhuǎn)化子PCR檢測30-31
• 3.2.6 陽性轉(zhuǎn)化子Southern blot驗證31-32
• 3.2.7 Vmpg7/Vmpg8基因雙敲除32-33
• 3.2.8 基因敲除回復(fù)33-36
• 3.3 結(jié)果與分析36-38
• 3.3.1 基因單敲除片段擴增及載體構(gòu)建36
• 3.3.2 基因單敲除突變體檢測36-37
• 3.3.3 Vmpg7/Vmpg8雙敲除突變體檢測37-38
• 3.3.4 Vmpg7、Vmpg8回復(fù)突變體檢測38
• 3.4 結(jié)論與討論38-40
• 第四章 突變體表型分析40-47
• 4.1 材料、儀器與試劑40
• 4.1.1 材料40
• 4.1.2 儀器40
• 4.1.3 試劑40
• 4.2 試驗方法40-41
• 4.2.1 營養(yǎng)生長分析40
• 4.2.2 果膠酶活性測定40-41
• 4.2.3 致病力檢測41
• 4.2.4 對果膠的利用41
• 4.2.5 數(shù)據(jù)分析41
• 4.3 結(jié)果與分析41-45
• 4.3.1 營養(yǎng)生長分析41-42
• 4.3.2 胞外果膠酶活力檢測42-43
• 4.3.3 致病力檢測43-44
• 4.3.4 對果膠的利用44-45
• 4.4 結(jié)論與討論45-47
• 第五章 家族內(nèi)基因表達水平分析47-50
• 5.1 材料、儀器與試劑47
• 5.1.1 材料47
• 5.1.2 儀器47
• 5.1.3 試劑47
• 5.2 試驗方法47-48
• 5.2.1 接種取樣47
• 5.2.2 RNA提取及c DNA合成47
• 5.2.3 q RT-PCR驗證家族內(nèi)其它基因的表達水平47-48
• 5.3 結(jié)果與分析48-49
• 5.4 結(jié)論與討論49-50
• 第六章 全文結(jié)論50-51
• 參考文獻51-57
• 附錄57-62
• 致謝62-63
• 作者簡介63

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