本文關(guān)鍵詞：大興安嶺土壤木聚糖酶基因多樣性分析及其基因克隆與表達(dá)

  更多相關(guān)文章： 大興安嶺 木聚糖酶 基因組測序 群落多樣性 基因克隆與表達(dá)

【摘要】：近年來,能源短缺和環(huán)境污染已經(jīng)成為全球不容忽視的問題,開發(fā)和利用可再生資源是解決這些問題的最佳途徑,而對木聚糖降解和利用是方法之一。木聚糖酶主要分為糖苷水解酶家族的GH10和GH11。目前,通過基因克隆、體外表達(dá)和蛋白純化等方法進(jìn)行的木聚糖酶相關(guān)研究已有很多,但這些研究主要集中于純培養(yǎng)的微生物,而對土壤中大量未培養(yǎng)微生物的木聚糖酶基因相關(guān)研究還較少,本文對微生物木聚糖酶基因進(jìn)行多樣性分析、基因克隆和表達(dá)研究,并可能獲得酶活較高的、可用于實踐的目的基因,同時希望更加全面的認(rèn)識木聚糖酶基因。大興安嶺森林區(qū)土壤表層土壤木質(zhì)纖維素豐富、蘊(yùn)含著大量產(chǎn)木聚糖降解酶的微生物。本文采集了該區(qū)域的森林表層土壤,利用高通量測序分別分析其中微生物種類和糖苷水解酶家族中GH10及GI11 1基因的多樣性,對其中的一些可能為新木聚糖酶的基因進(jìn)行了克隆和體外表達(dá)。研究的主要研究結(jié)果和結(jié)論如下：1、微生物種類多樣性：16S rDNA測序得到的27273條序列中,蛋白菌門中的鞘脂單胞菌屬(Sphingomonas)種群屬于第一優(yōu)勢菌,占全部的6.75%,其次是蛋白菌門中的產(chǎn)卟啉桿菌屬(Porphyrobacter)類群和慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium)類群的細(xì)菌,分別占全部的5.58%和4.3%。Alpha多樣性指標(biāo)中香農(nóng)指數(shù)為7.002407,ACE指數(shù)為14704.052,Chaol指數(shù)為10049.676。2、木聚糖酶基因多樣性：從土壤宏基因組DNA中擴(kuò)增GH10和GH11家族的木聚糖酶基因片段中,獲得1144個GH10木聚糖酶片段序列和2712個GH11木聚糖酶片段序列。序列比對分析表明GH10家族的最高相似性范圍為35%-90%,構(gòu)建的進(jìn)化樹分為8個分支,優(yōu)勢菌屬為堆囊菌屬(sorangium);GH11家族的最高相似性范圍為48%-94%,構(gòu)建的進(jìn)化樹分為11個分支,優(yōu)勢菌屬為鏈霉菌屬(Streptomyces)。3、基因克隆和表達(dá)：從環(huán)境樣中利用反向PCR成功克隆出xynH6基因全長,并在大腸桿菌BL21 (DE3)中進(jìn)行表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn)木聚糖酶酶活為11 U/mL。以上結(jié)果表明,大興安嶺表層土壤中微生物種類多樣性和木聚糖酶基因多樣性較高,且其中一些木聚糖酶基因序列具有較高的新穎性；土壤中GH10木聚糖酶的基因多樣性和新穎性要高于GH11。本研究為大興安嶺森林未培養(yǎng)微生物木聚糖酶基因的多樣性和利用提供基礎(chǔ)依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：大興安嶺 木聚糖酶 基因組測序 群落多樣性 基因克隆與表達(dá)
【學(xué)位授予單位】：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S714.3
【目錄】：

• 摘要3-4
• Abstract4-9
• 1 前言9-23
• 1.1 木聚糖概述9-10
• 1.2 木聚糖酶簡介10-16
• 1.2.1 木聚糖酶的分類11-15
• 1.2.2 木聚糖酶催化作用15-16
• 1.3 木聚糖酶的分子結(jié)構(gòu)區(qū)域16-17
• 1.4 木聚糖酶的來源17-18
• 1.5 木聚糖酶的酶活性18-19
• 1.6 木聚糖酶分子克隆及基因工程19-20
• 1.7 木聚糖酶的應(yīng)用20-22
• 1.7.1 飼料工業(yè)中的應(yīng)用20
• 1.7.2 造紙工業(yè)中的應(yīng)用20-21
• 1.7.3 食品工業(yè)中的應(yīng)用21
• 1.7.4 能源及環(huán)境保護(hù)方面的應(yīng)用21-22
• 1.8 本研究的內(nèi)容、目的和意義22-23
• 2 材料與方法23-33
• 2.1 實驗材料及設(shè)備23-25
• 2.1.1 采樣23
• 2.1.2 菌株和載體23
• 2.1.3 主要化學(xué)試劑23
• 2.1.4 主要試劑盒及工具酶23-24
• 2.1.5 主要儀器設(shè)備24
• 2.1.6 培養(yǎng)基24
• 2.1.7 實驗試劑24-25
• 2.1.8 引物25
• 2.2 土壤微生物宏基因組DNA的提取和純化25-26
• 2.3 16S rDNA測序及多樣性分析26-27
• 2.4 GH10、GH11家族木聚糖酶基因片段的測序及系統(tǒng)發(fā)育分析27
• 2.4.1 基因片段的擴(kuò)增、測序27
• 2.4.2 基因片段的序列分析27
• 2.4.3 GH10、GH11木聚糖酶基因系統(tǒng)發(fā)育分析27
• 2.5 GH10、11木聚糖酶的多樣性分析27-28
• 2.6 GH10木聚糖酶基因xynH6的克隆28-30
• 2.6.1 目標(biāo)基因序列的選擇28
• 2.6.2 木聚糖酶全長序列的擴(kuò)增28-30
• 2.7 xynH6木聚糖酶基因的轉(zhuǎn)化與表達(dá)方法30-33
• 2.7.1 目的基因的擴(kuò)增30
• 2.7.2 目的基因的連接轉(zhuǎn)化與鑒定30-32
• 2.7.3 目的基因在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)32
• 2.7.4 誘導(dǎo)表達(dá)蛋白的聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析32
• 2.7.5 木聚糖酶酶活檢測32-33
• 3 結(jié)果與分析33-52
• 3.1 土壤宏基因組DNA33
• 3.2 16S rDNA多樣性33-39
• 3.2.1 原始數(shù)據(jù)去除嵌合體及靶區(qū)域外序列33-34
• 3.2.2 操作分類單元(OTU)分類34
• 3.2.3 屬水平群落結(jié)構(gòu)分析34-36
• 3.2.4 Alpha多樣性分析36-39
• 3.3 GH10家族木聚糖酶基因多樣性分析39-43
• 3.3.1 土壤中GH10木聚糖酶的序列分析39-40
• 3.3.2 大興安嶺土壤環(huán)境中GH10木聚糖酶基因片段的系統(tǒng)發(fā)育分析40-42
• 3.3.3 大興安嶺土壤環(huán)境中GH10木聚糖酶基因片段的豐度分析42-43
• 3.4 GH11家族木聚糖酶基因多樣性分析43-49
• 3.4.1 土壤中GH11木聚糖酶的序列分析43-45
• 3.4.2 大興安嶺土壤環(huán)境中GH11木聚糖酶基因片段的系統(tǒng)發(fā)育分析45-48
• 3.4.3 大興安嶺土壤環(huán)境中GH11木聚糖酶基因片段的豐度分析48-49
• 3.5 木聚糖酶基因的異源表達(dá)49-52
• 3.5.1 木聚糖酶基因xynH6的擴(kuò)增49-50
• 3.5.2 木聚糖酶基因xynH6的克隆50
• 3.5.3 木聚糖酶基因xynH6的誘導(dǎo)表達(dá)及其活性檢測50-52
• 4 討論與結(jié)論52-55
• 4.1 討論52-53
• 4.1.1 土壤微生物種類多樣性52
• 4.1.2 木聚糖酶基因來源多樣性52-53
• 4.2 結(jié)論53-55
• 致謝55-56
• 參考文獻(xiàn)56-63
• 附錄63-73
• 作者簡介73

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本文編號：554829