本文關(guān)鍵詞：PCV2優(yōu)勢T、B細(xì)胞表位與截短cap基因串聯(lián)的構(gòu)建、原核表達(dá)及免疫原性研究

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【摘要】：豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)是目前全球養(yǎng)豬業(yè)具有重要經(jīng)濟(jì)意義的重要病毒性病原體之一,現(xiàn)將與其感染相關(guān)的疾病統(tǒng)稱為豬圓環(huán)病毒相關(guān)病(PCVAD),其中危害最嚴(yán)重的是仔豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)。PCV2主要侵害機(jī)體的免疫系統(tǒng),造成嚴(yán)重的免疫抑制,從而容易發(fā)生其他致病性微生物的繼發(fā)或混合感染,嚴(yán)重危害豬群健康。自2006年豬圓環(huán)病毒2型疫苗問世以來,疫苗的免疫接種成為防治豬圓環(huán)病毒病的主要手段。目前四種商品化疫苗已在世界范圍內(nèi)廣泛使用,其中兩種都是以PCV2 Cap蛋白作為免疫原,實(shí)驗(yàn)和現(xiàn)場研究已經(jīng)清晰地表明PCV2疫苗具有降低病毒血癥、消除PCVAD、增加生長性能等方面的功效,但是在免疫接種的豬群中仍然會發(fā)生PCVAD,這意味著現(xiàn)有商品化疫苗的免疫接種無法完全阻止PCV2感染或傳播;此外,還有全病毒培養(yǎng)獲得的病毒滴度低、滅活不徹底導(dǎo)致毒力返強(qiáng)、價格昂貴和保護(hù)率差等可能性。因此,開發(fā)新的安全有效的疫苗對控制PCV2感染是十分必要的。PCV2 ORF2編碼的Cap蛋白是病毒主要的結(jié)構(gòu)蛋白并且具有型特異性表位,一直以來也是PCV2重組疫苗的靶向物,但是針對其他因素對Cap蛋白免疫原性影響的研究卻很少。因此,本研究致力于尋找一種能增強(qiáng)Cap蛋白免疫原性的方法以期提高Cap蛋白亞單位疫苗的免疫效果。為了在原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)PCV2截短Cap蛋白與T、B細(xì)胞表位的串聯(lián)重組蛋白,并評價其免疫原性,我們根據(jù)之前的報道分別篩選了Rep和Cap蛋白上的T、B細(xì)胞表位后送去合成基因,然后將截短cap基因和合成的表位基因依次插入到pET-32a載體,共獲得三種重組質(zhì)粒:pET-B-cap、pET-T-cap和pET-T-B-cap。依次PCR、雙酶切和DNA測序鑒定,結(jié)果證明成功構(gòu)建三種重組表達(dá)質(zhì)粒,之后轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)感受態(tài),在IPTG誘導(dǎo)下表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE和Western blot分析驗(yàn)證,大小分別約為49、46和54 kDa,主要以包涵體形式存在,并具有較好的反應(yīng)原性。分別用獲得的rB-Cap、rT-Cap和rT-B-Cap蛋白制備的疫苗免疫SPF級BALB/c小鼠,間接ELISA抗體檢測結(jié)果顯示以上疫苗都能激發(fā)較高水平的Cap蛋白抗體,其中以rT-B-Cap組的抗體水平最高,且顯著高于r Cap和商品化全病毒滅活疫苗組,表明同時串聯(lián)T、B優(yōu)勢抗原表位的Cap蛋白免疫原性得到提高。優(yōu)勢表位串聯(lián)Cap蛋白較好的抗原性凸顯了以Cap蛋白為基礎(chǔ)的疫苗在防治PCV2病毒感染方面的顯著效果,并且也可能提供了一種用于提高基于表位的疫苗抗原性的方法。
【關(guān)鍵詞】：PCV2 Cap蛋白 表位 串聯(lián)表達(dá) 免疫接種
【學(xué)位授予單位】：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.65
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-7
• 本文常用縮寫詞中英文對照7-12
• 1 前言12-17
• 1.1 豬圓環(huán)病毒2型研究進(jìn)展12-16
• 1.1.1 病原學(xué)12
• 1.1.2 培養(yǎng)特性12-13
• 1.1.3 病毒基因組13
• 1.1.4 編碼的主要蛋白13-14
• 1.1.5 主要免疫優(yōu)勢表位14-15
• 1.1.6 防控措施15-16
• 1.2 本研究的目的和意義16-17
• 2 材料與方法17-33
• 2.1 材料17-19
• 2.1.1 質(zhì)粒、菌株、毒株和血清17
• 2.1.2 主要試劑17
• 2.1.3 主要儀器17-18
• 2.1.4 本文主要試劑配制方法18-19
• 2.1.4.1 SDS-PAGE所用溶液的配制18
• 2.1.4.2 Western blot所用溶液的配制18-19
• 2.1.4.3 其它試劑的配制19
• 2.2 方法19-33
• 2.2.1 PCV2 cap基因與表位基因的克隆19-23
• 2.2.1.1 引物設(shè)計與合成19-20
• 2.2.1.2 表位基因的合成20-21
• 2.2.1.3 PCV2-LG株DNA的提取21-22
• 2.2.1.4 PCV2 cap基因和表位基因的擴(kuò)增22
• 2.2.1.5 純化回收目的基因片段22-23
• 2.2.2 表達(dá)載體的構(gòu)建23-28
• 2.2.2.1 表達(dá)載體pET-cap的構(gòu)建23-26
• 2.2.2.2 表達(dá)載體pET-B-cap、pET-T-cap和pET-T-B-cap的構(gòu)建26-28
• 2.2.3 串聯(lián)重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及檢測28-29
• 2.2.3.1 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)28
• 2.2.3.2 重組蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化28-29
• 2.2.3.3 重組蛋白的Western blot檢測29
• 2.2.4 重組蛋白的制備及內(nèi)毒素去除處理29-31
• 2.2.4.1 重組蛋白的可溶性分析29-30
• 2.2.4.2 重組蛋白準(zhǔn)備及內(nèi)毒素去除30
• 2.2.4.3 去內(nèi)毒素處理和復(fù)性后重組蛋白的SDS-PAGE檢測30
• 2.2.4.4 處理后重組蛋白的Western blot檢測30
• 2.2.4.5 重組蛋白濃度的測定30-31
• 2.2.5 疫苗的制備31
• 2.2.6 重組蛋白免疫原性研究31-32
• 2.2.6.1 實(shí)驗(yàn)動物分組31
• 2.2.6.2 免疫程序及收集血清31-32
• 2.2.7 常規(guī)ELISA方法操作流程32
• 2.2.8 間接ELISA檢測鼠血清特異性抗體32-33
• 2.2.8.1 待檢血清最佳稀釋度的確定32
• 2.2.8.2 商品化ELISA試劑盒用法32
• 2.2.8.3 操作步驟32-33
• 2.2.8.4 注意事項33
• 3 結(jié)果與分析33-48
• 3.1 PCV2 cap基因的克隆33-34
• 3.2 重組表達(dá)質(zhì)粒pET-cap的PCR及雙酶切鑒定34-35
• 3.3 基因序列測定和分析35
• 3.4 表位基因的擴(kuò)增35-36
• 3.5 三種串聯(lián)重組表達(dá)質(zhì)粒的PCR及雙酶切鑒定36-37
• 3.6 基因序列測定和分析37
• 3.7 表達(dá)產(chǎn)物的鑒定37-43
• 3.7.1 串聯(lián)重組蛋白的SDS-PAGE檢測37-42
• 3.7.2 目的蛋白的Western blot檢測42-43
• 3.8 疫苗的制備43-45
• 3.8.1 內(nèi)毒素去除效果檢測43
• 3.8.2 內(nèi)毒素去除及復(fù)性處理后的目的蛋白SDS-PAGE檢測43-44
• 3.8.3 內(nèi)毒素去除及復(fù)性后的重組蛋白的Western blot檢測44-45
• 3.8.4 復(fù)性后目的蛋白濃度測定45
• 3.9 間接ELISA檢測小鼠免疫后血清抗體45-48
• 3.9.1 小鼠免疫血清最佳稀釋度的確定45-46
• 3.9.2 酶標(biāo)二抗最佳工作濃度的確定46
• 3.9.3 鼠血清ELISA檢測結(jié)果46-48
• 4 討論與結(jié)論48-51
• 全文總結(jié)51-52
• 致謝52-53
• 參考文獻(xiàn)53-59
• 附錄A:PCV2 cap基因序列59-60
• 附錄B:三段合成的表位基因序列60-61
• 附錄C:碩士期間科研成果61

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前5條

1 董林;王艷萍;沈志強(qiáng);柳增善;;豬圓環(huán)病毒2型多表位串聯(lián)體誘導(dǎo)表達(dá)及其免疫活性[J];中國獸醫(yī)學(xué)報;2014年11期

2 田曉婷;李寶玉;柳紀(jì)省;;豬圓環(huán)病毒2型兩種重組多表位蛋白免疫效果的評價[J];中國獸醫(yī)科學(xué);2012年10期

3 蔣偉;袁遠(yuǎn)華;廖曉鴻;蘇丹萍;賀東生;;豬圓環(huán)病毒2型多抗原表位串聯(lián)在大腸桿菌中表達(dá)與反應(yīng)原性分析[J];中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報;2012年08期

4 徐志文;郭萬柱;唐玉香;朱玲;陳燕凌;徐凱;梅淼;;PPV VP2基因與PCV2 ORF2不同抗原表位重組真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其免疫原性[J];中國獸醫(yī)學(xué)報;2011年11期

5 楊曉農(nóng);郭萬柱;徐志文;王新;殷華平;王小玉;龍虎;;ORF3基因缺失對豬圓環(huán)病毒Ⅱ型感染復(fù)制能力的影響[J];中國獸醫(yī)學(xué)報;2008年09期

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本文編號：551932