本文關(guān)鍵詞：興安落葉松幾丁質(zhì)酶基因的克隆及特性分析

  更多相關(guān)文章： 興安落葉松 表達(dá)特性 幾丁質(zhì)酶基因 耐寒性 轉(zhuǎn)基因擬南芥

【摘要】：興安落葉松(Larix gmelinii)主要分布于我國(guó)東北地區(qū),是森林生態(tài)系統(tǒng)中的優(yōu)勢(shì)樹(shù)種,既能在高寒環(huán)境下生存,又能在復(fù)雜的逆境條件下正常生長(zhǎng),是研究植物抗逆基因的良好材料。幾丁質(zhì)酶是一種植物抗逆相關(guān)蛋白,特別是在植物抵御病害及低溫的過(guò)程中發(fā)揮重要的作用,它具有熱滯活性,能夠降低冰點(diǎn)、抑制冰晶生長(zhǎng)及重結(jié)晶,從而保護(hù)植物免受凍害。本研究以分析幾丁質(zhì)酶在興安落葉松抵御低溫中所發(fā)揮的作用,探討其在提高轉(zhuǎn)基因植物抗寒性中的可應(yīng)用性為目的,通過(guò)RT-PCR技術(shù)克隆得到了一個(gè)興安落葉松幾丁質(zhì)酶基因,命名為L(zhǎng)gChi2。LgChi2 cDNA全長(zhǎng)包含一個(gè)831bp的開(kāi)放閱讀框,編碼276個(gè)氨基酸,蛋白分子量為28.4kDa,理論等電點(diǎn)為7.83,DNA全長(zhǎng)為1395bp,包含兩個(gè)內(nèi)含子,三個(gè)外顯子。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示,LgChi2與挪威云杉、花旗松、日本柳杉等植物的classIV幾丁酶基因具有極高的同源性。利用基因槍法轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細(xì)胞對(duì)LgChi蛋白的亞細(xì)胞定位進(jìn)行分析的結(jié)果顯示,LgChi::GFP融合蛋白定位于細(xì)胞邊緣。表達(dá)特性分析結(jié)果顯示,該基因主要表達(dá)在興安落葉松的幼莖中,在4℃低溫脅迫條件下,LgChi2的表達(dá)量明顯增加,顯示該基因?yàn)檎T導(dǎo)型表達(dá)基因。同時(shí),低溫脅迫條件下興安落葉松幾丁質(zhì)酶的活性呈先升高后下降的趨勢(shì),進(jìn)一步顯示幾丁質(zhì)酶基因在興安落葉松抵御低溫脅迫中發(fā)揮作用。為進(jìn)一步分析該基因在植物適應(yīng)低溫脅迫中的應(yīng)答機(jī)制,我們分別構(gòu)建了真核的雙元表達(dá)載體pBI101-LgChi和原核表達(dá)載體pET32a(+)-LgChi,并通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化的方法深入分析其在提高轉(zhuǎn)基因生物抗寒性中的作用。結(jié)果表明,pET32a(+)-LgChi重組菌經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè),觀察到與預(yù)期大小一致的融合表達(dá)蛋白,同時(shí),LgChi基因在大腸桿菌DE3中超表達(dá),增強(qiáng)了細(xì)胞在低溫脅迫下的生長(zhǎng)速度。低溫脅迫下,轉(zhuǎn)LgChi基因擬南芥和野生型擬南芥的三種抗氧化物酶即過(guò)氧化氫酶(CAT)、抗壞血酸過(guò)氧化物酶(APX)和過(guò)氧化物酶(POD)的活性均增加,但轉(zhuǎn)基因擬南芥的增幅明顯大于野生型擬南芥,顯示該基因在提高轉(zhuǎn)基因植物耐寒性中發(fā)揮重要作用。以上研究結(jié)果為進(jìn)一步分析興安落葉松幾丁質(zhì)酶基因的功能、表達(dá)調(diào)控機(jī)理及興安落葉松的抗寒分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ),同時(shí)也為利用興安落葉松的幾丁質(zhì)酶基因進(jìn)行農(nóng)作物及林木的抗寒性遺傳改良提供了有價(jià)值的候選基因。
【關(guān)鍵詞】：興安落葉松 表達(dá)特性 幾丁質(zhì)酶基因 耐寒性 轉(zhuǎn)基因擬南芥
【學(xué)位授予單位】：內(nèi)蒙古大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：S791.222;Q943.2
【目錄】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-11
• 第一章 文獻(xiàn)綜述11-20
• 1.1 興安落葉松11-12
• 1.1.1 形態(tài)特征11
• 1.1.2 生長(zhǎng)環(huán)境與分布范圍11
• 1.1.3 研究現(xiàn)狀11-12
• 1.2 幾丁質(zhì)酶12-17
• 1.2.1 幾丁質(zhì)酶參與植物體內(nèi)的新陳代謝12-13
• 1.2.2 幾丁質(zhì)酶研究進(jìn)展13-17
• 1.3 低溫脅迫與植物耐寒機(jī)制17-18
• 1.3.1 低溫對(duì)植物的傷害17
• 1.3.2 植物的抗凍性17-18
• 1.3.3 冷害機(jī)制與植物抗凍性的生理指標(biāo)18
• 1.4 研究意義及技術(shù)路線(xiàn)18-20
• 1.4.1 研究意義18-19
• 1.4.2 技術(shù)路線(xiàn)19-20
• 第二章 幾丁質(zhì)酶基因cDNA全長(zhǎng)克隆及生物信息學(xué)分析20-31
• 2.1 材料和方法20-23
• 2.1.1 植物材料及培養(yǎng)20
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及其配制20-21
• 2.1.3 利用RT-PCR技術(shù)克隆興安落葉松LgChi基因片段21-23
• 2.1.4 興安落葉松幾丁質(zhì)酶基因的生物信息學(xué)分析23
• 2.1.5 興安落葉松幾丁質(zhì)酶的系統(tǒng)進(jìn)化分析23
• 2.1.6 興安落葉松幾丁質(zhì)酶基因DNA全長(zhǎng)的克隆23
• 2.2 結(jié)果和分析23-29
• 2.2.1 LgChi2基因cDNA全長(zhǎng)的克隆23-24
• 2.2.2 LgChi2基因DNA全長(zhǎng)的克隆24
• 2.2.3 興安落葉松幾丁質(zhì)酶基因LgChi1/2的序列分析24-26
• 2.2.4 興安落葉松幾丁質(zhì)酶基因的生物信息學(xué)分析26-28
• 2.2.5 LgChi1/2系統(tǒng)進(jìn)化分析28-29
• 2.3 討論29-31
• 第三章 興安落葉松幾丁質(zhì)酶基因的表達(dá)特性分析31-41
• 3.1 材料和方法31-35
• 3.1.1 半定量RT-PCR分析31
• 3.1.2 低溫脅迫興安落葉松幾丁質(zhì)酶活性測(cè)定31-32
• 3.1.3 興安落葉松幾丁質(zhì)酶的亞細(xì)胞定位分析32-35
• 3.2 結(jié)果和分析35-39
• 3.2.1 LgChi表達(dá)特性分析35-36
• 3.2.2 低溫處理對(duì)興安落葉松幾丁質(zhì)酶活性影響36-37
• 3.2.3 興安落葉松幾丁質(zhì)酶基因的亞細(xì)胞定位分析37-39
• 3.3 討論39-41
• 第四章 興安落葉松幾丁質(zhì)酶基因LgChi1/2的原核表達(dá)分析41-48
• 4.1 材料和方法41-44
• 4.1.1 菌種和質(zhì)粒41
• 4.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及配制41-42
• 4.1.3 原核表達(dá)載體構(gòu)建42-43
• 4.1.4 融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)43-44
• 4.1.5 低溫脅迫轉(zhuǎn)基因大腸桿菌44
• 4.2 結(jié)果和分析44-47
• 4.2.1 興安落葉松幾丁質(zhì)酶基因LgChi1/2原核表達(dá)載體構(gòu)建44-46
• 4.2.2 LgChi1和LgChi2融合蛋白的誘導(dǎo)46
• 4.2.3 LgChi基因表達(dá)影響大腸桿菌在低溫脅迫下的存活率46-47
• 4.3 討論47-48
• 第五章 興安落葉松幾丁質(zhì)酶基因LgChi1/2在擬南芥中的異源表達(dá)48-61
• 5.1 材料和方法48-54
• 5.1.1 pBI101-LgChi重組表達(dá)載體的構(gòu)建48-51
• 5.1.2 擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化、篩選、鑒定51-52
• 5.1.3 轉(zhuǎn)基因擬南芥的表型分析及抗氧化物酶酶活性測(cè)定52-54
• 5.2 結(jié)果和分析54-59
• 5.2.1 pBI101-LgChi1/2重組表達(dá)載體的構(gòu)建54-56
• 5.2.2 擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化、篩選、鑒定56-57
• 5.2.3 轉(zhuǎn)基因擬南芥的表型分析和抗氧化物酶活性測(cè)定57-59
• 5.3 討論59-61
• 第六章 結(jié)論61-62
• 參考文獻(xiàn)62-68
• 致謝68

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1 李峰;周廣勝;曹銘昌;;興安落葉松地理分布對(duì)氣候變化響應(yīng)的模擬[J];應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào);2006年12期

2 王國(guó)林;;興安落葉松葉芽開(kāi)放期與大豆高產(chǎn)期的研究與應(yīng)用[J];黑龍江科技信息;2013年06期

3 徐振邦,戴洪才,陳華,單建平,戴力民,邵春海,楊善勛;1989年大興安嶺圖強(qiáng)林業(yè)局興安落葉松結(jié)實(shí)狀況[J];生態(tài)學(xué)雜志;1992年03期

4 許貴，白鳴祺，王芳;興安落葉松裸根苗培育與氣象因子的關(guān)系[J];氣象;1995年03期

5 喬辰,弓彩霞;十八個(gè)產(chǎn)地興安落葉松種皮微形態(tài)的研究[J];植物研究;1996年04期

6 班勇，徐化成;原始老齡林內(nèi)興安落葉松種子命運(yùn)的試驗(yàn)研究[J];生態(tài)學(xué)報(bào);1996年05期

7 劉軍，呂金印，，李樹(shù)蓉;興安落葉松幼苗對(duì)~（32）P的吸收與累積研究[J];西北植物學(xué)報(bào);1996年06期

8 邱揚(yáng),李湛東,徐化成;興安落葉松種群的穩(wěn)定性與火干擾關(guān)系的研究[J];植物研究;1997年04期

9 嚴(yán)善春;袁紅娥;王琪;王艷軍;;葉損傷誘導(dǎo)興安落葉松針葉中10種酚酸的變化[J];應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào);2010年04期

10 武雪冬;杜寶昌;王麗;陳霞;劉炳友;;興安落葉松主要病蟲(chóng)害防治技術(shù)[J];中國(guó)西部科技;2011年31期

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1 卓麗環(huán);王玲;;兩種材色興安落葉松種子生物學(xué)特性的比較研究[A];加入WTO和中國(guó)科技與可持續(xù)發(fā)展——挑戰(zhàn)與機(jī)遇、責(zé)任和對(duì)策（下冊(cè)）[C];2002年

2 馬海波;魏江生;周梅;王林和;;興安落葉松原始林胸徑與邊材面積的相關(guān)性分析[A];2007自然科學(xué)學(xué)術(shù)論文（土壤肥料與農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展）[C];2007年

3 張培杲;楊書(shū)文;鮑務(wù)立;;興安落葉松種子區(qū)的初步區(qū)劃[A];全國(guó)林木遺傳育種第五次學(xué)術(shù)報(bào)告會(huì)論文匯編[C];1986年

4 吳克賢;李偉;樓玉海;;興安落葉松結(jié)實(shí)規(guī)律及其影響因子[A];面向21世紀(jì)的中國(guó)林木遺傳育種——中國(guó)林學(xué)會(huì)林木遺傳育種第四屆年會(huì)文集[C];1997年

5 ;興安落葉松的無(wú)性繁殖[A];全國(guó)林木遺傳育種第五次學(xué)術(shù)報(bào)告會(huì)論文匯編[C];1986年

6 董文華;;高寒地區(qū)興安落葉松扦插育苗的試驗(yàn)研究[A];科技創(chuàng)新與經(jīng)濟(jì)結(jié)構(gòu)調(diào)整——第七屆內(nèi)蒙古自治區(qū)自然科學(xué)學(xué)術(shù)年會(huì)優(yōu)秀論文集[C];2012年

7 余利敏;林曉飛;張文波;;興安落葉松幾丁質(zhì)酶基因的克隆及特性分析[A];2013全國(guó)植物生物學(xué)大會(huì)論文集[C];2013年

8 王玉華;劉澗櫻;曹化榮;唐春生;高景文;;大興安嶺興安落葉松的起源及生物特性[A];2003年內(nèi)蒙古自治區(qū)自然科學(xué)學(xué)術(shù)年會(huì)優(yōu)秀論文集[C];2003年

9 余濤;郝建璽;;興安落葉松側(cè)枝生長(zhǎng)初步研究[A];2003年內(nèi)蒙古自治區(qū)自然科學(xué)學(xué)術(shù)年會(huì)優(yōu)秀論文集[C];2003年

10 許易琦;;興安落葉松引種試驗(yàn)區(qū)內(nèi)的地理變異規(guī)律及最佳種源選擇[A];面向21世紀(jì)的中國(guó)林木遺傳育種——中國(guó)林學(xué)會(huì)林木遺傳育種第四屆年會(huì)文集[C];1997年

中國(guó)重要報(bào)紙全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 ;興安落葉松人工開(kāi)花技術(shù)研究成功[N];今日信息報(bào);2004年

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1 卓麗環(huán);興安落葉松種內(nèi)紅材型與變異類(lèi)型-白材型的比較研究[D];東北林業(yè)大學(xué);2002年

2 徐偉;興安落葉松誘導(dǎo)抗蟲(chóng)性研究[D];東北林業(yè)大學(xué);2006年

3 那冬晨;興安落葉松地理種源遺傳多樣性與利用研究[D];東北林業(yè)大學(xué);2005年

4 楊秀麗;大興安嶺興安落葉松森林生態(tài)系統(tǒng)菌根及其真菌多樣性研究[D];內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué);2010年

5 王天龍;興安落葉松真空干燥脫脂過(guò)程中松節(jié)油遷移特性及機(jī)理的研究[D];北京林業(yè)大學(xué);2006年

6 高濤;大氣環(huán)流和海溫變化對(duì)興安落葉松生長(zhǎng)的氣候影響[D];內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

7 張訓(xùn)亞;興安落葉松木材性質(zhì)的聲—超聲技術(shù)預(yù)測(cè)[D];中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院;2011年

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 楊柳;干旱對(duì)興安落葉松水分參數(shù)的影響[D];東北林業(yè)大學(xué);2015年

2 劉玉佳;模擬干旱與變暖對(duì)興安落葉松徑向生長(zhǎng)的影響[D];東北林業(yè)大學(xué);2015年

3 郭妍雪;人工興安落葉松心邊材的變異特征[D];東北林業(yè)大學(xué);2015年

4 張朋磊;興安落葉松對(duì)氣候變化響應(yīng)的時(shí)間穩(wěn)定性分析[D];東北林業(yè)大學(xué);2015年

5 張麗;興安落葉松幾丁質(zhì)酶基因的克隆及特性分析[D];內(nèi)蒙古大學(xué);2016年

6 白學(xué)平;興安落葉松徑向生長(zhǎng)對(duì)氣候響應(yīng)的滯后性研究[D];沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué);2016年

7 喬明星;興安落葉松咖啡酸-O-甲基轉(zhuǎn)移酶基因的克隆及特性分析[D];內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué);2016年

8 宋彩玲;內(nèi)蒙古大興安嶺興安落葉松光合生理生態(tài)特性研究[D];內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué);2009年

9 朱曉明;不同緯度興安落葉松水分參數(shù)對(duì)比研究[D];東北林業(yè)大學(xué);2008年

10 霍宏;氣候暖化對(duì)興安落葉松光合和生長(zhǎng)影響的研究[D];東北林業(yè)大學(xué);2007年

本文編號(hào)：544770