本文關(guān)鍵詞：寡孢節(jié)叢孢中milRNAs 764、799的基因敲除及其靶基因與功能的預(yù)測(cè)

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【摘要】：寡孢節(jié)叢孢(Arthrobotrys oligospora)是最早報(bào)道的能以粘性菌網(wǎng)捕捉線蟲的捕食線蟲真菌。本論文以寡孢節(jié)叢孢milRNAs 764、799為實(shí)驗(yàn)對(duì)象(因?yàn)橹巴ㄟ^(guò)預(yù)測(cè)與實(shí)驗(yàn)證明milRNA764可以與qde-2蛋白結(jié)合成RNAi復(fù)合體,可能在寡孢節(jié)叢孢捕器形成過(guò)程中發(fā)揮作用。而且經(jīng)過(guò)篩選這兩個(gè)小RNAs都是表達(dá)量較好的milRNAs,所以本論文要研究這兩個(gè)milRNAs的功能。),采用基因敲除手段初次研究了在寡孢節(jié)叢孢生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中這兩個(gè)milRNAs的功能,并用InterProScan等軟件預(yù)測(cè)了其靶基因及其靶基因的功能。主要取得以下實(shí)驗(yàn)結(jié)果：電轉(zhuǎn)化酵母,構(gòu)建了milRNAs編碼基因的敲除載體,運(yùn)用CaCl2-PEG介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法對(duì)寡孢節(jié)叢孢原生質(zhì)體進(jìn)行了轉(zhuǎn)化。結(jié)果顯示,這兩個(gè)milRNAs的敲除株在菌落生長(zhǎng)速度及大小,孢子產(chǎn)生,逆境生長(zhǎng)等方面與野生型的寡孢節(jié)叢孢并沒(méi)有什么區(qū)別。但是,milRNA799在尿素誘導(dǎo)過(guò)程中捕器產(chǎn)生的數(shù)目少于野生型。最后本文用RNAhybrid, pita, targetscan, miranda, RNA22等軟件對(duì)靶基因進(jìn)行了預(yù)測(cè),篩選出了最可能的靶基因。并通過(guò)blast, InterProScan預(yù)測(cè)了milRNAs 764、799靶基因的功能。本文創(chuàng)新點(diǎn)：1.對(duì)寡孢節(jié)叢孢中兩個(gè)milRNAs 764、799編碼基因進(jìn)行了敲除,比較了野生型與敲除突變株的表型,并對(duì)這兩個(gè)milRNAs的功能進(jìn)行了初步預(yù)測(cè)。2.篩選出了這兩個(gè)milRNAs最可能的靶基因并對(duì)這些靶基因進(jìn)行了功能方面的預(yù)測(cè)。
【關(guān)鍵詞】：寡孢節(jié)叢孢 milRNAs 基因敲除 捕器 靶基因
【學(xué)位授予單位】：云南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q78;S476
【目錄】：

• 摘要3-4
• Abstract4-7
• 第一章 研究綜述7-19
• 1.1 捕食線蟲真菌的生物防治7-10
• 1.1.1 線蟲的危害7-8
• 1.1.2 捕食線蟲真菌—線蟲的克星8-9
• 1.1.3 寡孢節(jié)叢孢的研究現(xiàn)狀9-10
• 1.2 小RNA的簡(jiǎn)介及功能研究進(jìn)展10-19
• 1.2.1 小RNA的種類11-12
• 1.2.2 小RNA的生成途徑12-14
• 1.2.3 小RNA生成途徑中的關(guān)鍵蛋白因子14
• 1.2.4 小RNA的作用機(jī)制14-16
• 1.2.5 小RNA的功能及應(yīng)用16-19
• 第二章 MilRNAs編碼基因敲除載體的構(gòu)建19-31
• 2.1 前言19-20
• 2.2 實(shí)驗(yàn)用品及儀器20-22
• 2.2.1 實(shí)驗(yàn)菌株和質(zhì)粒20
• 2.2.2 實(shí)驗(yàn)所用的培養(yǎng)基20-21
• 2.2.3 實(shí)驗(yàn)藥品及試劑21
• 2.2.4 主要儀器及設(shè)備21-22
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法22-25
• 2.3.1 敲除片段的引物設(shè)計(jì)22
• 2.3.2 寡孢節(jié)叢孢總DNA提取22
• 2.3.3 質(zhì)粒pSCN44的提取22
• 2.3.4 擴(kuò)增目的片段22-24
• 2.3.5 擴(kuò)增及酶切基因的膠回收24
• 2.3.6 酵母感受態(tài)制備及電轉(zhuǎn)24-25
• 2.3.7 酵母轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒提取25
• 2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果25-29
• 2.4.1 寡孢節(jié)叢孢中2個(gè)milRNAs編碼基因同源片段及hph擴(kuò)增25-26
• 2.4.2 pRS426質(zhì)粒酶切結(jié)果26
• 2.4.3 酵母的電轉(zhuǎn)結(jié)果26-27
• 2.4.4 驗(yàn)證酵母轉(zhuǎn)化子27-29
• 2.5 討論與小結(jié)29-31
• 第三章 寡孢節(jié)叢孢原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和驗(yàn)證31-41
• 3.1 前言31
• 3.2 實(shí)驗(yàn)用品及儀器31-32
• 3.2.1 實(shí)驗(yàn)菌株31
• 3.2.2 主要溶液及培養(yǎng)基31-32
• 3.2.3 藥品及試劑32
• 3.2.4 主要儀器及設(shè)備32
• 3.3 實(shí)驗(yàn)方法32-35
• 3.3.1 敲除載體全長(zhǎng)片段擴(kuò)增及回收32
• 3.3.2 寡孢節(jié)叢孢原生質(zhì)體的制備32
• 3.3.3 寡孢節(jié)叢孢原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化32-33
• 3.3.4 寡孢節(jié)叢孢敲除轉(zhuǎn)化子基因組提取33
• 3.3.5 敲除轉(zhuǎn)化子的PCR驗(yàn)證33
• 3.3.6 敲除轉(zhuǎn)化子的Southern blot驗(yàn)證33-35
• 3.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果35-39
• 3.4.1 原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化子驗(yàn)證35-36
• 3.4.2 Southern blot驗(yàn)證敲除株36-39
• 3.5 討論與小結(jié)39-41
• 第四章 寡孢節(jié)叢孢野生型菌株與敲除菌株的表型比較41-61
• 4.1 前言41
• 4.2 實(shí)驗(yàn)用品及儀器41-42
• 4.2.1 實(shí)驗(yàn)菌株41
• 4.2.2 主要培養(yǎng)基41
• 4.2.3 主要藥品41
• 4.2.4 主要儀器及設(shè)備41-42
• 4.3 實(shí)驗(yàn)方法42-43
• 4.3.1 生長(zhǎng)速率的比較42
• 4.3.2 孢子產(chǎn)生的比較42
• 4.3.3 產(chǎn)捕器比較42-43
• 4.3.4 抗逆生長(zhǎng)情況比較43
• 4.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果43-59
• 4.4.1 生長(zhǎng)速率比較43-48
• 4.4.2 孢子產(chǎn)生的比較48-49
• 4.4.3 產(chǎn)捕器比較49-54
• 4.4.4 抗逆生長(zhǎng)情況比較54-59
• 4.5 討論與小結(jié)59-61
• 第五章 MilRNAs 764、799靶基因及其功能預(yù)測(cè)61-67
• 5.1 MilRNAs 764、799靶基因的預(yù)測(cè)61-63
• 5.2 MilRNAs 764、799靶基因功能的預(yù)測(cè)63-65
• 5.3 小結(jié)及展望65-67
• 參考文獻(xiàn)67-70
• 附錄70-72
• 碩士期間發(fā)表論文及所獲獎(jiǎng)勵(lì)72-73
• 致謝73

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