發(fā)布時(shí)間：2017-07-08 17:21

  本文關(guān)鍵詞：虎紋蛙MHCⅠ類(lèi)、Ⅱ類(lèi)基因的克隆與多態(tài)性分析

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【摘要】：MHC (Major histocompatibility complex)即主要組織相容性復(fù)合體,是脊椎動(dòng)物中直接介導(dǎo)免疫反應(yīng)的一類(lèi)細(xì)胞表面蛋白。MHC基因即是編碼這類(lèi)蛋白的基因家族,許多的研究已經(jīng)表明MHC基因家族是脊椎動(dòng)物體內(nèi)變異最大的功能基因之一,具有較高的其變異主要出現(xiàn)在抗原結(jié)合部位,因?yàn)樵摬课慌c動(dòng)物抵抗病原體的能力以及對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性直接相關(guān),所以很多研究集中分析這個(gè)變異最大的區(qū)域。對(duì)于MHC Ⅰ類(lèi)、Ⅱ類(lèi)基因來(lái)說(shuō),exon3與exon2分別編碼其抗原結(jié)合部位,是變異最大的區(qū)域,了解該區(qū)域的變異特性能為進(jìn)一步研究生態(tài)學(xué)中的適應(yīng)性進(jìn)化、性選擇等問(wèn)題提供便利。而目前兩棲類(lèi)MHC基因的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和進(jìn)化模式的研究非常有限,為了更加系統(tǒng)全面的了解兩棲類(lèi)MHC基因的多態(tài)性情況,本研究的目標(biāo)是從虎紋蛙(Hoplobatrachus chinensis)中克隆MHC Ⅰ類(lèi)exon3基因與Ⅱ類(lèi)exon2基因,并分析其多態(tài)性的維持機(jī)制。本文首先通過(guò)設(shè)計(jì)通用引物成功的獲得了MHC基因Ⅰ類(lèi)exon3 126bp, MHC Ⅱ類(lèi)exon2 132bp。我們通過(guò)常規(guī)PCR方法以及Genomic Walking的方法共獲得虎紋蛙MHC Ⅰ類(lèi)基因1020bp,Ⅱ類(lèi)基因2020bp,其中包含了全部的外顯子部分。通過(guò)設(shè)計(jì)虎紋蛙特異性引物分別擴(kuò)增虎紋蛙MHC Ⅰ類(lèi)exon3與Ⅱ類(lèi)exon2。然后在碧蓮、大若巖與下廖三個(gè)種群中檢測(cè)虎紋蛙的MHC Ⅰ類(lèi)、Ⅱ類(lèi)基因的多態(tài)性。獲得了如下的研究結(jié)果：1、在27個(gè)野生虎紋蛙個(gè)體中檢測(cè)出Ⅰ類(lèi)等位基因10條,而在一個(gè)個(gè)體中最多達(dá)到了7個(gè),表明虎紋蛙MHC Ⅰ類(lèi)基因最少具有4個(gè)基因座；II類(lèi)等位基因檢測(cè)到7條等位基因,在一個(gè)個(gè)體中最多達(dá)到3個(gè)等位基因,表明虎紋蛙MHC Ⅱ類(lèi)基因最少有2個(gè)基因座。2、通過(guò)DNAsp軟件計(jì)算出其I類(lèi)基因的10條等位基因的核苷酸序列變異位點(diǎn)為27.3%；II類(lèi)基因的7條等位基因的核苷酸序列變異位點(diǎn)為13%。3、通過(guò)MEGA6.0計(jì)算所得到等位基因的氨基酸距離以及核苷酸距離,結(jié)果得到MHCⅠ類(lèi)與Ⅱ類(lèi)的氨基酸距離均大于核苷酸距離,暗示其經(jīng)歷過(guò)正選擇,4、利用MEGA與一些其他在線(xiàn)程序一共檢測(cè)到Ⅰ類(lèi)6個(gè)正選擇位點(diǎn),其中有3個(gè)位于假定的抗原結(jié)合區(qū)；Ⅱ類(lèi)一共檢測(cè)到5個(gè)正選擇位點(diǎn),其中有兩個(gè)位于抗原結(jié)合區(qū)。所以,我們得出虎紋蛙的MHC基因受到的正選擇作用可能與寄生蟲(chóng)調(diào)控的平衡選擇有關(guān)。5、通過(guò)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹(shù)以及GRAD在線(xiàn)檢測(cè),均未發(fā)現(xiàn)有重組現(xiàn)象以及跨物種多態(tài)性。本研究為以后虎紋蛙的后續(xù)研究提供了較好的理論基礎(chǔ)和分子標(biāo)記。1、可以作為一種與功能相關(guān)的分子標(biāo)記來(lái)研究虎紋蛙的不同地理種群的地理變異,也可以將虎紋蛙和其它兩棲類(lèi)聯(lián)系起來(lái)系統(tǒng)的闡釋兩棲類(lèi)基因的進(jìn)化模式。2、可以將該基因與虎紋蛙抵抗病原菌的能力聯(lián)系起來(lái),揭示虎紋蛙抗病的分子機(jī)制。3、可以用該基因與虎紋蛙的配偶選擇聯(lián)系起來(lái),揭示虎紋蛙的配偶選擇機(jī)制。
【關(guān)鍵詞】：MHC基因 多態(tài)性 正選擇 虎紋蛙
【學(xué)位授予單位】：浙江師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：Q953
【目錄】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-10
• 第一章 文獻(xiàn)綜述10-22
• 1 MHC基因結(jié)構(gòu)與功能10-11
• 1.1 MHC Ⅰ類(lèi)基因的分布與結(jié)構(gòu)10
• 1.2 MHC Ⅱ類(lèi)基因的分布與結(jié)構(gòu)10-11
• 2 兩棲類(lèi)MHC基因多態(tài)性研究進(jìn)展11-13
• 2.1 兩棲類(lèi)MHC基因研究現(xiàn)狀11-12
• 2.2 MHC Ⅰ類(lèi)基因多態(tài)性研究進(jìn)展12-13
• 2.3 MHC Ⅱ類(lèi)基因多態(tài)性研究進(jìn)展13
• 3 MHC多態(tài)性維持機(jī)制13-17
• 3.1 MHC多態(tài)性的產(chǎn)生14
• 3.1.1 基因突變14
• 3.1.2 基因重組14
• 3.2 MHC基因多態(tài)性的維持14-17
• 3.2.1 寄生蟲(chóng)的誘導(dǎo)15
• 3.2.2 性選擇15-16
• 3.2.3 跨物種多態(tài)性16-17
• 4 兩棲類(lèi)MHC多態(tài)性研究的應(yīng)用17-18
• 4.1 種群遺傳多樣性的分析應(yīng)用17
• 4.2 抗病能力分析中應(yīng)用17-18
• 5 虎紋蛙研究進(jìn)展18-20
• 5.1 分類(lèi)地位以及分布18
• 5.1.1 虎紋蛙的分類(lèi)以及形態(tài)特征18
• 5.1.2 虎紋蛙資源現(xiàn)狀18
• 5.2 虎紋蛙研究進(jìn)展18-20
• 5.2.1 形態(tài)學(xué)研究19
• 5.2.2 生理生化研究19
• 5.2.3 分子遺傳學(xué)研究19-20
• 6 本研究的意義和目的20-22
• 第二章 材料與方法22-36
• 1 實(shí)驗(yàn)材料22-23
• 1.1 樣本的采集22
• 1.2 主要儀器和設(shè)備22-23
• 1.3 主要的實(shí)驗(yàn)試劑23
• 2 主要實(shí)驗(yàn)方法的步驟23-26
• 2.1 基于RNA水平的相關(guān)實(shí)驗(yàn)23-25
• 2.1.1 RNA的提取以及檢測(cè)24
• 2.1.2 逆轉(zhuǎn)錄24-25
• 2.2 基于DNA水平的相關(guān)實(shí)驗(yàn)25
• 2.3 感受態(tài)細(xì)胞的制備25-26
• 3 引物的設(shè)計(jì)26-32
• 3.1 DNA水平上設(shè)計(jì)引物26-27
• 3.2 RNA水平上設(shè)計(jì)引物27
• 3.3 Genomic Walking引物設(shè)計(jì)27-28
• 3.4 虎紋蛙MHC特異性引物的設(shè)計(jì)28-32
• 4 虎紋蛙MHC Ⅰ類(lèi)exon3的克隆32-33
• 4.1 SSCP過(guò)程32-33
• 4.2 PAGE割膠回收33
• 4.3 DNA條帶的再次擴(kuò)增與克隆33
• 5 虎紋蛙MHC Ⅱ類(lèi)基因exon2的克隆33-34
• 6 數(shù)據(jù)分析34-36
• 6.1 等位基因的確定和序列的對(duì)比34
• 6.2 計(jì)算遺傳距離多樣性指標(biāo)34-35
• 6.3 選擇信號(hào)檢測(cè)35
• 6.4 重組檢測(cè)35-36
• 第三章 結(jié)果分析36-48
• 1 虎紋蛙MHC Ⅰ類(lèi)結(jié)果分析36-43
• 1.1 從RNA上設(shè)計(jì)引物得到的結(jié)果36
• 1.2 通用引物擴(kuò)增結(jié)果36-37
• 1.3 Genome walking擴(kuò)增結(jié)果37
• 1.4 SSCP結(jié)果37
• 1.5 序列多態(tài)性分析37-38
• 1.6 核苷酸序列多態(tài)性分析38
• 1.7 氨基酸序列分析38-39
• 1.8 正選擇位點(diǎn)的分析39-41
• 1.9 跨物種多態(tài)性分析41-43
• 1.10 重組檢測(cè)43
• 2 虎紋蛙MHC Ⅱ類(lèi)基因結(jié)果分析43-48
• 2.1 DNA上得到的結(jié)果43
• 2.1.1 通用引物擴(kuò)增結(jié)果43
• 2.1.2 Genome walking擴(kuò)增結(jié)果43
• 2.2 序列多態(tài)性分析43-44
• 2.3 核苷酸序列多態(tài)性44-45
• 2.4 選擇信號(hào)的檢測(cè)45-46
• 2.5 跨物種多態(tài)性分析46-47
• 2.6 重組檢測(cè)47-48
• 第四章 討論48-52
• 1 引物設(shè)計(jì)48
• 2 基因座位數(shù)目48-49
• 3 正選擇49-50
• 4 跨物種多態(tài)性50-51
• 5 重組現(xiàn)象51-52
• 第五章 小結(jié)和展望52-53
• 1 小結(jié)52
• 2 展望52-53
• 參考文獻(xiàn)53-65
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的研究論文65
• 攻讀學(xué)位期間參加的科研項(xiàng)目65-66
• 致謝66-68

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前3條

1 陳東海;邵晨;王宇;;虎紋蛙微衛(wèi)星位點(diǎn)的跨種引物篩選[J];湖北第二師范學(xué)院學(xué)報(bào);2011年02期

2 劉麗;劉楚吾;郭昱嵩;湯恩埔;彭向文;;基于RAPD的SCAR分子標(biāo)記技術(shù)鑒定虎紋蛙及引進(jìn)種[J];海洋湖沼通報(bào);2008年02期

3 邵晨,施時(shí)迪,謝建芳;酸脅迫對(duì)虎紋蛙紅細(xì)胞及血紅蛋白的影響[J];農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào);2005年01期

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本文編號(hào)：535566