本文關(guān)鍵詞：山羊痘病毒N1L基因缺失重組毒株的構(gòu)建及其生物特性研究

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【摘要】：本研究以GTPV基因組為模板,以N1L基因側(cè)翼序列為同源重組左右臂構(gòu)建了表達(dá)綠色熒光蛋白及黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶的轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒pLR-EGFP-gpt。將pLR-EGFP-gpt與GTPV共轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞(非洲綠猴腎細(xì)胞)并在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生同源重組,通過加壓篩選純化出缺失N1L基因的重組病毒GTPV△N1L。采用相同方法在pLR-EGFP-gpt中反向插入N1L基因表達(dá)盒構(gòu)建了N1基因缺失后再拯救的重組轉(zhuǎn)移載體pLR-EGFP-gpt-N1Lrev,并與GTPV共轉(zhuǎn)染后篩選出恢復(fù)突變的重組病毒GTPV N1Lrev。遺傳穩(wěn)定性和生物學(xué)特性鑒定證實,GTPV △ N1L能在至少10代內(nèi)穩(wěn)定遺傳,且在細(xì)胞病變和生長性能等方面與親本毒株相比均未發(fā)生顯著改變,但是相同毒價的GTPV △ N1L與親本毒株在病毒拷貝數(shù)上相差30倍,初步證實缺失N1L基因并沒有對病毒在培養(yǎng)細(xì)胞中復(fù)制產(chǎn)生太大影響,但是使病毒毒力有一定程度的降低,表明N1L可能為病毒毒力因子之一。擴(kuò)增GTPV N1L全長基因,構(gòu)建了N1L基因的真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-N1L并轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞,經(jīng)G418加壓篩選,采用RT-PCR和Western-blotting分析鑒定,成功獲得了3株穩(wěn)定表達(dá)N1L基因的Hela多克隆細(xì)胞株。本研究為深入探討N1蛋白的生物學(xué)活性及在GTPV致病過程中的作用,闡明GTPV的發(fā)病機(jī)理奠定基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：山羊痘病毒 同源重組 基因缺失 重組病毒
【學(xué)位授予單位】：廣西大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.65
【目錄】：

• 摘要4-6
• abstract6-10
• 引言10-12
• 第一章 文獻(xiàn)綜述12-30
• 1.1 羊痘病毒的研究概況12-17
• 1.1.1 病原的分類及形態(tài)特征12
• 1.1.2 地理分布12-13
• 1.1.3 宿主范圍13-14
• 1.1.4 傳播方式14-15
• 1.1.5 臨床癥狀及發(fā)病機(jī)制15
• 1.1.6 CaPV的免疫應(yīng)答15-16
• 1.1.7 CaPV的疫苗16-17
• 1.2 痘病毒宿主范圍及毒力相關(guān)基因的研究概況17-29
• 1.2.1 痘病毒的基因組結(jié)構(gòu)和宿主范圍18-19
• 1.2.2 痘病毒毒力基因和宿主范圍基因19-28
• 1.2.3 痘病毒N1L基因研究概況28-29
• 1.3 本研究的目的與意義29-30
• 第二章 山羊痘病毒N1L基因缺失重組毒株的構(gòu)建及其生物特性研究30-55
• 2.1 材料和方法30-43
• 2.1.1 材料30-32
• 2.1.2 方法32-34
• 2.1.3 轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒pLR-EGFP-gpt和pLR-EGFP-gpt-N1Lrev的構(gòu)建及鑒定34-39
• 2.1.4 重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒轉(zhuǎn)染條件的優(yōu)化39
• 2.1.5 重組病毒GTPV△N1L和GTPV N1Lrev的制備、篩選和純化39-40
• 2.1.6 GTPV P32熒光定量PCR檢測方法40-42
• 2.1.7 重組病毒的生物學(xué)特性鑒定42-43
• 2.2 結(jié)果43-51
• 2.2.1 同源重組臂基因片段的克隆結(jié)果43-44
• 2.2.2 重組轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒的構(gòu)建鑒定結(jié)果44
• 2.2.3 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染條件優(yōu)化結(jié)果44
• 2.2.4 重組病毒GTPV△N1L和GTPV N1Lrev的制備、純化及PCR鑒定結(jié)果44-46
• 2.2.5 GTPV P32 Taqman熒光定量PCR檢測方法的建立46-48
• 2.2.6 重組病毒的生物學(xué)特性鑒定48-51
• 2.3 討論51-55
• 2.3.1 基因缺失轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒的設(shè)計與構(gòu)建51-52
• 2.3.2 優(yōu)化共轉(zhuǎn)染條件,提高重組效率52-53
• 2.3.3 重組病毒的篩選與鑒定53
• 2.3.4 缺失N1基因?qū)Σ《旧L和致病性的影響53-55
• 第三章 穩(wěn)定表達(dá)山羊痘病毒N1L基因的Hela細(xì)胞系篩選55-65
• 3.1 材料和方法55-60
• 3.1.1 材料55-56
• 3.1.2 方法56-60
• 3.2 結(jié)果60-62
• 3.2.1 真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-N1L酶切鑒定結(jié)果60
• 3.2.2 G418工作濃度和最佳轉(zhuǎn)染條件的確定60
• 3.2.3 抗性Hela細(xì)胞株RT-PCR的檢測60-62
• 3.2.4 抗性Hela細(xì)胞Westem-blot結(jié)果62
• 3.3 討論62-65
• 3.3.1 瞬時轉(zhuǎn)染與穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的區(qū)別62-63
• 3.3.2 痘病毒N1蛋白的研究背景63-64
• 3.3.3 構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)GTPVN1蛋白的Hela細(xì)胞株64-65
• 第四章 結(jié)論65-66
• 參考文獻(xiàn)66-79
• 致謝79-80
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文80

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