發(fā)布時(shí)間：2017-07-05 07:00

  本文關(guān)鍵詞：鼠李糖乳桿菌肽聚糖對(duì)雞外周血單核細(xì)胞抗菌肽基因表達(dá)的影響及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑

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【摘要】：抗菌肽是生物體天然免疫的重要成分,它們不僅具有廣譜抗菌作用,還可作為細(xì)胞間免疫效應(yīng)分子通過多重機(jī)制發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能和抗感染作用。防御素和Cathelicidins是動(dòng)物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的兩個(gè)主要抗菌肽家族,在維持機(jī)體抗感染方面發(fā)揮重要作用。鼠李糖乳桿菌是一種腸道益生菌,從中提取的細(xì)胞壁肽聚糖在鼠李糖乳桿菌發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用特別是促進(jìn)抗菌肽表達(dá)方面起重要作用。然而有關(guān)肽聚糖促進(jìn)抗菌肽的表達(dá)而提高機(jī)體天然免疫和獲得性免疫應(yīng)答能力的調(diào)控機(jī)制仍未完全闡明。因此,本試驗(yàn)研究不同劑量的鼠李糖乳桿菌肽聚糖對(duì)雞外周血單核細(xì)胞中抗菌肽β-防御素9(β-defensin 9,AvBD9)和Cathelicidin-B1(Cath-B1)基因表達(dá)的影響,并確定其最佳刺激濃度。同時(shí),采用熒光定量PCR的方法檢測(cè)肽聚糖促進(jìn)抗菌肽表達(dá)對(duì)可能相關(guān)受體基因表達(dá)的影響。此外,利用特異性抗Toll樣受體2(Toll-like receptor 2,TLR2)抗體封閉、特異性抑制劑抑制相關(guān)分子等方法進(jìn)一步探討鼠李糖乳桿菌肽聚糖調(diào)控AvBD9、Cath-B1基因表達(dá)的可能信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。試驗(yàn)結(jié)果如下:(1)不同濃度的鼠李糖乳桿菌細(xì)胞壁完整肽聚糖均能不同程度的促進(jìn)雞外周血單核細(xì)胞內(nèi)AvBD9、Cath-B1基因的表達(dá)。且我們發(fā)現(xiàn)促進(jìn)AvBD9基因表達(dá)的最佳刺激濃度為200μg/ml,促進(jìn)Cath-B1基因表達(dá)的最佳濃度為150μg/ml。(2)200μg/ml鼠李糖乳桿菌肽聚糖可促進(jìn)雞外周血單核細(xì)胞TLR2以及NOD樣受體1(NOD1)、NALP3的表達(dá),且NOD1的表達(dá)量極顯著高于對(duì)照組(P0.01)。(3)使用抗體封閉TLR2以及用抑制劑抑制NOD1后,與肽聚糖組相比,AvBD9和Cath-B1 mRNA的表達(dá)水平均顯著下降。且用Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn),TLR2抗體和NOD1抑制劑預(yù)處理后NF-κB p65、P38、JNK蛋白的磷酸化與非磷酸化的比值顯著下降(P㩳0.05)。(4)使用NF-kB特異性抑制劑PDTC,JNK MAPK特異性抑制劑SP600125,p38 MAPK特異性抑制劑SB203580,ERK1/2 MAPK特異性抑制劑SCH772984預(yù)處理雞外周血單核細(xì)胞后,PDTC、SB203580、SP600125均不同程度的降低鼠李糖乳桿菌肽聚糖誘導(dǎo)的AvBD9、Cath-B1基因的表達(dá),且PDTC抑制AvBD9、Cath-B1基因表達(dá)的幅度顯著高于SB203580、SP600125。而SCH772984預(yù)處理后,AvBD9、Cath-B1基因的表達(dá)量反而不同程度的上調(diào)了。綜上所述,鼠李糖乳桿菌完整肽聚糖可促進(jìn)雞外周血單核細(xì)胞中AvBD9、Cath-B1基因的表達(dá),且對(duì)于不同的基因肽聚糖的最佳刺激濃度不同。鼠李糖乳桿菌肽聚糖可促進(jìn)細(xì)胞表面TLR2受體、胞內(nèi)NOD1、NALP3受體基因的表達(dá),這表明肽聚糖促進(jìn)抗菌肽的表達(dá)可能是由TLR2或NOD1、NALP3介導(dǎo)。鼠李糖乳桿菌肽聚糖可通過TLR2或NOD1介導(dǎo)的NF-κB和MAPK信號(hào)途徑上調(diào)雞外周血單核細(xì)胞AvBD9、Cath-B1的表達(dá)而發(fā)揮益生作用,提高雞抗感染天然免疫功能。
【關(guān)鍵詞】：鼠李糖乳桿菌MLGA 完整肽聚糖 雞外周血單核細(xì)胞 禽β-防御素9 Cathelicidin-B1 Toll樣受體2 NOD樣受體1 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路
【學(xué)位授予單位】：江西農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S831
【目錄】：

• 摘要8-10
• Abstract10-12
• 英文縮寫表12-13
• 第一部分 文獻(xiàn)綜述13-24
• 1 抗菌肽的研究進(jìn)展13-16
• 1.1 抗菌肽概述13
• 1.2 禽抗菌肽的分類及分布13-14
• 1.3 禽抗菌肽的功能14-16
• 2 益生菌與抗菌肽的關(guān)系16-19
• 2.1 益生菌的益生作用16-17
• 2.2 益生菌誘導(dǎo)抗菌肽的表達(dá)17
• 2.3 益生菌促進(jìn)抗菌肽表達(dá)的菌種特異性17-18
• 2.4 益生菌的特定組分促進(jìn)宿主抗菌肽的表達(dá)18-19
• 3 誘導(dǎo)抗菌肽表達(dá)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑19-21
• 3.1 Toll-樣受體介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑19-20
• 3.2 NOD樣受體與抗菌肽表達(dá)20-21
• 4 本論文研究目的、研究意義、研究?jī)?nèi)容及技術(shù)路線21-24
• 4.1 研究目的、意義及內(nèi)容21-23
• 4.2 技術(shù)路線23-24
• 第二部分 試驗(yàn)部分24-55
• 試驗(yàn)一 鼠李糖乳桿菌MLGA細(xì)胞壁完整肽聚糖對(duì)雞外周血單核細(xì)胞抗菌肽AvBD9、Cath-B1基因表達(dá)的影響24-36
• 1 材料與方法25-31
• 1.1 試驗(yàn)材料25-27
• 1.1.1 試驗(yàn)菌株25
• 1.1.2 主要試驗(yàn)儀器設(shè)備25
• 1.1.3 主要試劑25-26
• 1.1.4 培養(yǎng)基26
• 1.1.5 試劑配制26-27
• 1.2 試驗(yàn)方法與步驟27-30
• 1.2.1 鼠李糖乳桿菌MLGA的培養(yǎng)27
• 1.2.2 鼠李糖乳桿菌MLGA細(xì)胞壁完整肽聚糖（whole peptidoglycan， WPG）的分離提取27
• 1.2.3 肽聚糖酶解產(chǎn)物的制備27-28
• 1.2.4 雞外周血單核細(xì)胞的分離與培養(yǎng)28
• 1.2.5 雞外周血單核細(xì)胞與鼠李糖乳桿菌MLGA細(xì)胞壁完整肽聚糖、肽聚糖酶解產(chǎn)物共培養(yǎng)及AvBD9、Cath-B1 mRNA表達(dá)的檢測(cè)28
• 1.2.6 外周血單核細(xì)胞總RNA的提取28-29
• 1.2.7 細(xì)胞總RNA反轉(zhuǎn)錄29
• 1.2.8 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR29-30
• 1.2.8.1 特異性引物和探針的設(shè)計(jì)及合成29-30
• 1.2.8.2 熒光定量PCR30
• 1.3 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析30-31
• 2 結(jié)果與分析31-34
• 2.1 細(xì)胞總RNA的提取31
• 2.2 AvBD9、Cath-B1、TLR2、NOD1、NALP3基因的PCR結(jié)果31-32
• 2.3 不同濃度鼠李糖乳桿菌細(xì)胞壁完整肽聚糖及其酶解產(chǎn)物對(duì)雞外周血單核細(xì)胞AvBD9 mRNA表達(dá)水平的影響32-33
• 2.4 不同濃度鼠李糖乳桿菌細(xì)胞壁完整肽聚糖及其酶解產(chǎn)物對(duì)Cath-B1基因表達(dá)的影響33-34
• 3 討論34-35
• 4 小結(jié)35-36
• 試驗(yàn)二 鼠李糖乳桿菌MLGA細(xì)胞壁完整肽聚糖誘導(dǎo)雞外周血單核細(xì)胞抗菌肽基因表達(dá)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑36-55
• 1 材料與方法37-43
• 1.1 試驗(yàn)材料37-38
• 1.1.1 主要試驗(yàn)儀器設(shè)備37-38
• 1.1.2 主要試劑38
• 1.2 試驗(yàn)方法與步驟38-42
• 1.2.1 鼠李糖乳桿菌細(xì)胞壁完整肽聚糖與雞外周血單核細(xì)胞共培養(yǎng)38-39
• 1.2.1.1 鼠李糖乳桿菌細(xì)胞壁完整肽聚糖對(duì)TLR2、NOD1、NALP3、AvBD9、Cath-B1 mRNA表達(dá)的影響38
• 1.2.1.2 特異性抗體封閉TLR2后，，鼠李糖乳桿菌MLGA細(xì)胞壁完整肽聚糖對(duì)雞外周血單核細(xì)胞抗菌肽AvBD9、Cath-B1、MyD88基因表達(dá)的影響38-39
• 1.2.1.3 特異性抑制劑抑制NOD1后鼠李糖乳桿菌MLGA細(xì)胞壁完整肽聚糖對(duì)雞外周血單核細(xì)胞抗菌肽AvBD9、Cath-B1基因表達(dá)的影響39
• 1.2.1.4 刺激后細(xì)胞總RNA的提取39
• 1.2.1.5 總RNA反轉(zhuǎn)錄39
• 1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)AvBD9、Cath-B1、TLR2、MyD88、NOD1、NALP3基因表達(dá)水平39-40
• 1.2.2.1 特異性引物和探針的設(shè)計(jì)及合成39-40
• 1.2.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR40
• 1.2.3 TLR2、NOD1介導(dǎo)的外周血單核細(xì)胞信號(hào)通路的研究40-42
• 1.2.3.1 特異性抗體封閉TLR2后，Western Bolt檢測(cè)鼠李糖乳桿菌MLGA細(xì)胞壁完整肽聚糖刺激雞外周血單核細(xì)胞后對(duì)NF-κB和AP-1 通路中相關(guān)蛋白的影響40-41
• 1.2.3.2 特異性抑制劑抑制NOD1后，Western Bolt檢測(cè)鼠李糖乳桿菌MLGA細(xì)胞壁完整肽聚糖刺激雞外周血單核細(xì)胞后對(duì)NF-κB和AP-1 通路中相關(guān)蛋白的影響41
• 1.2.3.3 信號(hào)通路阻斷實(shí)驗(yàn)41
• 1.2.3.4 蛋白質(zhì)提取41
• 1.2.3.5 核蛋白質(zhì)定量41-42
• 1.2.3.6 Wetern Bolt（WB）檢測(cè)42
• 1.3 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析42-43
• 2 結(jié)果與分析43-49
• 2.1 TLR2、NOD1、NALP3、MyD88基因PCR結(jié)果圖43-44
• 2.2 鼠李糖乳桿菌細(xì)胞壁完整肽聚糖對(duì)雞外周血單核細(xì)胞AvBD9、Cath-B1、TLR2、NOD1、NALP3 mRNA表達(dá)的影響44
• 2.3 特異性抗體封閉TLR2后鼠李糖乳桿菌細(xì)胞壁完整肽聚糖對(duì)雞外周血單核細(xì)胞抗菌肽AvBD9、Cath-B1、MyD88基因表達(dá)的影響44-46
• 2.4 特異性NOD1抑制劑處理雞外周血單核細(xì)胞后鼠李糖乳桿菌MLGA細(xì)胞壁完整肽聚糖對(duì)其抗菌肽AvBD9、Cath-B1基因表達(dá)的影響46-48
• 2.5 特異性抑制劑阻斷NF-κB和AP-1 信號(hào)通路后鼠李糖乳桿菌細(xì)胞壁完整肽聚糖對(duì)雞外周血單核細(xì)胞抗菌肽AvBD9、Cath-B1基因表達(dá)的影響48-49
• 3 討論49-54
• 4 小結(jié)54-55
• 全文總結(jié)55-56
• 參考文獻(xiàn)56-65
• 致謝65

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