本文關(guān)鍵詞：可控性Speedy A基因表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠模型的建立鑒定及表型分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的哺乳動(dòng)物的精子發(fā)生是一個(gè)高度復(fù)雜的細(xì)胞分裂與分化過程,許多生精細(xì)胞特異性基因的表達(dá)和調(diào)控具有發(fā)育階段特異性的特征,任一階段的異常都有可能導(dǎo)致雄性不育,因此,研究精子發(fā)生過程中起重要作用的睪丸特異性基因,并對(duì)這些基因的表達(dá)特征及其在精子發(fā)生過程中所起的生物學(xué)功能進(jìn)行深入研究,對(duì)理解精子發(fā)生的內(nèi)在機(jī)理、防治精子發(fā)生異常引起的男性不育、研制男性避孕藥及保健藥等具有重要意義。Speedy/Ringo基因是一類新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)激活因子,在精子發(fā)生過程中起重要作用。利用四環(huán)素(tetracycline, Tet)基因調(diào)控表達(dá)系統(tǒng)可以在時(shí)間和空間上實(shí)現(xiàn)對(duì)基因的可控性表達(dá),為基因功能的研究提供有效的解決途徑。本文旨在建立基于Tet-On系統(tǒng)誘導(dǎo)表達(dá)的Speedy A基因RNA干擾轉(zhuǎn)基因小鼠模型,研究Speedy A基因表達(dá)下調(diào)對(duì)精子發(fā)生的影響,并且探討Tet-On系統(tǒng)在研究精子發(fā)生相關(guān)基因中的應(yīng)用。方怯利用生物信息學(xué)軟件,按照RNA干擾序列設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)RNA干擾靶點(diǎn)序列,構(gòu)建質(zhì)粒后轉(zhuǎn)染大腸桿菌,篩選陽(yáng)性菌并驗(yàn)證插入序列,慢病毒包裝干擾片段后感染精母細(xì)胞,Real-time PCR檢測(cè)下調(diào)Speedy A基因表達(dá)的有效干擾片段；Gateway技術(shù)構(gòu)建包含有效干擾片段和四環(huán)素反應(yīng)元件(TRE)的質(zhì)粒,建立轉(zhuǎn)基因小鼠并篩選到純合子,然后與四環(huán)素調(diào)控的反式激活子(rtTA)轉(zhuǎn)基因小鼠雜交,篩選TRE和rtTA雙陽(yáng)性的小鼠,喂食強(qiáng)力霉素(Dox)誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)RNA干擾片段的表達(dá),下調(diào)Speedy A基因的表達(dá)水平,建立可控性Speedy A基因RNA干擾轉(zhuǎn)基因小鼠模型,以Real-time PCR及Western Blot分別檢測(cè)模型組小鼠與對(duì)照組小鼠在mRNA水平以及蛋白水平Speedy A基因的表達(dá)差異；HE染色初步觀察睪丸組織形態(tài)學(xué)變化,TUNEL法檢測(cè)小鼠睪丸組織的細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了4個(gè)RNA干擾靶點(diǎn)序列,通過體外實(shí)驗(yàn)篩選下調(diào)Speedy A基因表達(dá)的有效干擾片段,Real-time PCR檢測(cè)到精母細(xì)胞中最佳干擾片段對(duì)Speedy A基因表達(dá)的敲減程度達(dá)75%(P0.01),為有效靶點(diǎn)；成功構(gòu)建了PDOWN-shSpdya入門克隆及pRP.EX2d-TREshSpdya表達(dá)克隆；成功建立了四環(huán)素誘導(dǎo)的Speedy A-RNA干擾轉(zhuǎn)基因小鼠模型,誘導(dǎo)RNA干擾片段表達(dá)后,實(shí)時(shí)熒光定量PCR及Western Blot結(jié)果顯示模型組小鼠與對(duì)照組小鼠相比S peedy A基因的表達(dá)量明顯下降；HE染色及TUNEL法檢測(cè)到模型組小鼠睪丸組織的精母細(xì)胞發(fā)生大量凋亡。結(jié)論本實(shí)驗(yàn)成功建立了基于Tet-On系統(tǒng)誘導(dǎo)表達(dá)的可控性Speedy A基因RNA干擾轉(zhuǎn)基因小鼠模型,說明可以基于Tet-On系統(tǒng)活體研究精子發(fā)生相關(guān)基因的功能；初步分析發(fā)現(xiàn)Speedy A基因表達(dá)下調(diào)使生精細(xì)胞發(fā)生異常凋亡。模型的成功建立為進(jìn)一步系統(tǒng)分析Speedy A基因在雄性生殖系統(tǒng)中的功能及其作用機(jī)制打下了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：TET-ON系統(tǒng) Speedy A基因 RNA干擾 精子發(fā)生 不育癥
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R698.2;R-332
【目錄】：

• 摘要4-5
• Abstract5-7
• 前言7-11
• 1. 男性不育與精子發(fā)生7
• 2. Tet-on系統(tǒng)調(diào)控的RNA干擾技術(shù)在精子發(fā)生研究中的應(yīng)用7-9
• 3. Speedy A基因簡(jiǎn)介9-11
• 第一節(jié) Speedy A基因RNA干擾序列設(shè)計(jì)及慢病毒載體制備11-23
• 材料和方法13-18
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果18-23
• 第二節(jié) RNA干擾序列病毒包裝與滴度測(cè)定23-30
• 材料和方法24-29
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果29-30
• 第三節(jié) RNA干擾有效靶點(diǎn)篩選30-35
• 材料和方法30-32
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果32-35
• 第四節(jié) 基于Tet-on系統(tǒng)的RNA干擾載體的構(gòu)建及可控性Speedy A基因表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠模型的建立35-45
• 材料和方法35-42
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果42-45
• 第五節(jié) 可控性Speedy A基因表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠模型的初步分析45-49
• 材料和方法45-48
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果48-49
• 討論49-51
• 結(jié)論51-52
• 參考文獻(xiàn)52-55
• 附錄1：綜述55-65
• 參考文獻(xiàn)60-65
• 附錄2：中英文縮略詞表65-67
• 附錄3：pRP.EX2d-TRE>shSpdya全序列67-69
• 附錄4：個(gè)人簡(jiǎn)介69-70
• 致謝70-71

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 吳金明,林菊生,陳碧濤,鄭新民,趙浩斌,梁擴(kuò)寰;乙型肝炎病毒基因組轉(zhuǎn)基因小鼠模型的制備與鑒定[J];中華肝臟病雜志;2003年06期

2 林紅英;殷潤(rùn)婷;奚濤;徐寒梅;;在腫瘤研究中轉(zhuǎn)基因小鼠模型的研究進(jìn)展[J];中國(guó)藥理學(xué)通報(bào);2007年01期

3 ;美國(guó)國(guó)家毒理學(xué)規(guī)劃討論轉(zhuǎn)基因小鼠模型[J];國(guó)外醫(yī)學(xué)(衛(wèi)生學(xué)分冊(cè));1998年04期

4 罕園園;馬開利;;阿爾茲海默癥轉(zhuǎn)基因小鼠模型研究進(jìn)展及評(píng)價(jià)[J];中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào);2013年06期

5 洪源;成軍;李莉;;丙型肝炎病毒轉(zhuǎn)基因小鼠模型的研究[J];世界華人消化雜志;2002年09期

6 董田甜;任雁;鄒莉波;李增剛;王捷;;轉(zhuǎn)基因小鼠模型在致癌實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用進(jìn)展[J];環(huán)境與職業(yè)醫(yī)學(xué);2011年08期

7 崔雄鷹;施小鳳;黃建松;劉萍;陶嵐嵐;周玉蘭;阮錚;奚曉東;;造血干細(xì)胞移植建立血小板整合素β3胞內(nèi)段截短體轉(zhuǎn)基因小鼠模型[J];中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志;2013年03期

8 馮世容;應(yīng)用四環(huán)素調(diào)控系統(tǒng)建立丙型肝炎轉(zhuǎn)基因小鼠模型獲得可喜進(jìn)展[J];中華醫(yī)學(xué)信息導(dǎo)報(bào);1998年23期

9 姚玉成,訾曉淵,李建秀,熊俊,李文林,金艷花,蘇小平,倪文君,胡以平,李振林,安靚,楊俊峰,羅清禮,張文,周久模;視蛋白基因啟動(dòng)子-綠色熒光蛋白融合基因轉(zhuǎn)基因小鼠模型的建立[J];第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2002年11期

10 張梅英;吳紅聯(lián);楊葳;李兆陽(yáng);董婉維;周生來;于洋;王惟;呂相川;秦英;鄭志紅;王祿增;;5-脂氧化酶轉(zhuǎn)基因小鼠模型的制備[J];中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào);2010年01期

中國(guó)重要會(huì)議論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 張梅英;吳紅聯(lián);楊葳;李兆陽(yáng);董婉維;周生來;于洋;王惟;呂相川;秦英;鄭志紅;王祿增;;5-脂氧化酶轉(zhuǎn)基因小鼠模型的制備[A];東北三省及內(nèi)蒙古地區(qū)遺傳學(xué)研究進(jìn)展學(xué)術(shù)研討會(huì)論文匯編[C];2009年

2 何學(xué)令;尹海林;黃磊;夏慶杰;;甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子-2持續(xù)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠模型建立[A];中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)會(huì)第七屆學(xué)術(shù)年會(huì)論文集[C];2006年

3 亓s，

本文編號(hào)：482176