本文關(guān)鍵詞：CSFV、BVDV雙重RT-PCR檢測方法的建立及E2基因遺傳進化分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：豬瘟(Classical Swine Fever Virus,CSFV),牛病毒性腹瀉(Bovine Viral Diarrhoea Virus,BVDV)均屬于黃病毒科瘟病毒屬成員,它們在結(jié)構(gòu)與抗原性方面具有相似性性,能夠產(chǎn)生交叉免疫學反應與交叉保護作用。由于這兩者都能感染豬,嚴重影響我國畜牧業(yè)的健康發(fā)展。CSFV主要感染豬,BVDV不僅能感染小反芻而且能感染家畜,其中懷孕母豬和仔豬最易感,其病理變化與臨床癥狀與慢性豬瘟類似。這不僅對該病的防制帶來一定的困擾且對本病的判斷帶來困難。從核苷酸同源性來看,BVDV與CSFV的核苷酸同源性約為60%,由于在血清學上存在交叉反應,容易與豬瘟相混淆,對該疾病的診斷帶來影響。近年來,我國豬瘟在臨床表現(xiàn)不典型,出現(xiàn)了所謂的“非典型豬瘟”、“溫和型豬瘟”和“帶毒母豬綜合征”,這些所謂的不典型豬瘟病理剖檢上也和典型豬瘟不相同。原因主要有以下兩點,一方面可能是我國長期疫苗防控,使得豬瘟病毒在免疫壓力下造成了免疫耐受,改變毒力和抗原的某些特性,另一方面可能是豬只在感染CSFV的同時感染了BVDV,兩者加劇了病毒的危害,對我國養(yǎng)殖業(yè)造成災難性的打擊。因此對豬感染BVDV的現(xiàn)狀必須有清醒的認識并應采取必要的防范措施,并且在疫苗生產(chǎn)過程中,要避免疫苗中BVDV的污染。根據(jù)當前豬瘟的這種變化,并且這兩種病毒感染豬后所長生的癥狀及其相似,臨床上通過癥狀很難鑒別診斷這兩種病毒。及時的鑒別診斷有助于后期豬場人員對這兩種病毒防控,有必要建立一種能夠同時對CSFV和BVDV進行鑒別檢測的方法。因此,本文開展以下幾個方面的研究:(1)使用MGEA4.0軟件比對分析CSFV,BVDV的核苷酸序列,尋找各自的特異性保守區(qū)并設計各自的特異性引物;(2)通過改變PCR過程中的退火溫度,優(yōu)化CSFV,BVDV各自的最佳退火溫度;(3)使用優(yōu)化好的退火溫度,對CSFV,BVDV以及豬場常見的幾種病毒進行特異性檢測;(4)通過不斷改變CSVF,BVDV的濃度,檢測能夠擴增CSFV,BVDV的最低核酸濃度,驗證引物的敏感性;(5)通過雙重RT-PCR檢測,最后檢驗CSFV,BVDV特異性引物所擴增的結(jié)果是否與預期結(jié)果相符。
【關(guān)鍵詞】：CSFV BVDV 序列比對 RT-PCR
【學位授予單位】：華南農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S852.65
【目錄】：

• 摘要3-4
• ABSTRACT4-6
• 英文縮寫對照表6-9
• 1 前言9-16
• 1.1 牛病毒性腹瀉病毒與豬瘟病毒的分類及分子結(jié)構(gòu)以及理化特征9-11
• 1.2 BVDV與CSFV的流行概況11-12
• 1.3 BVDV與CSFV的檢測技術(shù)12-13
• 1.4 豬感染BVDV的調(diào)查13-14
• 1.5 CSFV，BVDV的鑒別診斷方法14-15
• 1.6 本研究的目的和意義15-16
• 2 材料和方法16-29
• 2.1 材料16-18
• 2.1.1 常用軟件及生物信息學網(wǎng)站16
• 2.1.2 菌株、毒株、載體、細胞株16
• 2.1.3 常用酶類及試劑盒16
• 2.1.4 其他主要試劑16
• 2.1.5 主要實驗耗材16
• 2.1.6 實驗室主要儀器設備16-17
• 2.1.7 常用試劑的配置17-18
• 2.2 方法18-29
• 2.2.1 基因序列的下載與比對18
• 2.2.2 CSFV，BVDV的培養(yǎng)18-19
• 2.2.2.1 PK-15，MDBK 細胞的復蘇18
• 2.2.2.2 PK-15，MDBK 細胞的傳代18-19
• 2.2.2.3 BVDV，CSFV的擴增19
• 2.2.3 病毒核酸的提取及濃度的檢測19-20
• 2.2.4 CSFV，BVDV的RT-PCR條件的優(yōu)化20-21
• 2.2.5 CSFV，BVDV的特異性RT-PCR實驗21-22
• 2.2.6 CSFV，BVDV的敏感性RT-PCR檢測22-24
• 2.2.7 CSFV，BVDV的雙重RT-PCR檢測24-25
• 2.2.8 雙重RT-PCR產(chǎn)物的純化25-26
• 2.2.9 RT-PCR產(chǎn)物與p MD 19-T載體的連接26
• 2.2.10 DH5α 感受態(tài)細胞的制備26-27
• 2.2.11 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α 感受態(tài)細胞27
• 2.2.12 重組質(zhì)粒的菌液PCR鑒定和陽性質(zhì)粒的抽提27-29
• 2.2.13 CSFV，BVDV菌液PCR結(jié)果的測序29
• 3 實驗結(jié)果與分析29-34
• 3.1 CSFV，BVDV的RT-PCR條件的優(yōu)化29-30
• 3.2 CSFV，BVDV的特異性RT-PCR實驗30-31
• 3.3 CSFV，BVDV的敏感性RT-PCR檢測31-32
• 3.4 CSFV，BVDV的雙重RT-PCR檢測32
• 3.5 CSFV，BVDV的菌液RCR檢測32-33
• 3.6 臨床樣品檢測33-34
• 4 討論與結(jié)論34-36
• 4.1 序列的比對34-35
• 4.2 特異性檢測35
• 4.3 結(jié)論35-36
• 全文總結(jié)36-37
• 致謝37-38
• 參考文獻38-42

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 尹雙輝;尚佑軍;劉艷紅;藺芳;才學鵬;劉湘濤;;可溶性E2蛋白作為抗原的檢測豬瘟病毒血清抗體間接ELISA方法的建立[J];中國獸醫(yī)學報;2009年12期

2 張寧;秦建華;趙博偉;張富梅;胡曉悅;趙月蘭;;牛病毒性腹瀉-黏膜病診斷方法研究進展[J];動物醫(yī)學進展;2008年02期

3 舒黛廉,邢釗;牛病毒性腹瀉—黏膜病(BVD-MD)研究進展[J];中獸醫(yī)學雜志;2004年03期

  本文關(guān)鍵詞：CSFV、BVDV雙重RT-PCR檢測方法的建立及E2基因遺傳進化分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：476384