本文關(guān)鍵詞：延邊流行株犬瘟熱病毒H基因的原核表達(dá)及間接ELISA方法的建立，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：犬瘟熱(Canine Distemper, CD)是由犬瘟熱病毒(Canine Distemper Virus, CDV)感染而引起的急性傳染病,具有接觸性強(qiáng)、發(fā)病率和死亡率高等特點(diǎn),并可引起機(jī)體免疫抑制,是危害犬科類動物生命較為嚴(yán)重的傳染病之一,嚴(yán)重制約了我國養(yǎng)犬業(yè)、經(jīng)濟(jì)動物養(yǎng)殖業(yè)和野生動物保護(hù)業(yè)的發(fā)展。因此,建立一種快速、高效的特異性檢測方法對于該病的防控具有十分重要的意義。本試驗(yàn)采集延邊地區(qū)自然感染犬瘟熱病毒患病犬的組織病料,提取CDV全基因組,利用RT-PCR方法擴(kuò)增CDV-H基因,將其克隆至pMD18-T simple vector載體,構(gòu)建重組克隆質(zhì)粒pMD18T-CDV-H,并將pMD18T-CDV-H與pGEX-4T-1載體經(jīng)BamH I和Xho I雙酶切,構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-CDV-H,轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)表達(dá)菌株,通過對不同溫度、IPTG濃度、Amp+濃度和誘導(dǎo)時(shí)間等條件的優(yōu)化進(jìn)行重組蛋白的表達(dá),利用SDS-PAGE凝膠電泳對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行分離鑒定。將誘導(dǎo)表達(dá)出的重組蛋白進(jìn)行純化,利用Western-blot方法分析純化蛋白的反應(yīng)原性,并將純化后的重組蛋白免疫BALB/c小鼠,制備小鼠抗CDV蛋白多克隆抗體,檢測其抗體效價(jià),并利用純化抗原建立間接ELISA方法。結(jié)果顯示,CDV-H基因全長約為1824 bp,編碼607個(gè)氨基酸,該序列與近幾年GenBank中收錄的國內(nèi)外9株CDV-H基因核苷酸序列同源性為88.9-99.8%,氨基酸序列同源性為85.8-99.5%。經(jīng)SDS-PAGE鑒定,重組融合蛋白的分子量約為103 Ku,以包涵體形式存在。純化蛋白經(jīng)Western-blot分析鑒定,具有良好的反應(yīng)原性,免疫BALB/c小鼠可誘導(dǎo)其產(chǎn)生抗CDV-H抗體,抗體效價(jià)為1：64,證明該重組表達(dá)蛋白具有良好的免疫原性。通過對間接ELISA方法最適條件的篩選,得到重組蛋白最佳包被濃度為6.88μg/mL,血清最佳稀釋度為1：100,抗原最佳包被條件為4℃過夜,血清最佳作用條件為37℃1h,3%脫脂乳的最佳封閉條件為37℃3 h,辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗犬IgG的最佳稀釋倍數(shù)為1：5000,最佳作用條件為37℃1 h,底物最佳顯色條件為37℃15 mmin。通過對特異性試驗(yàn)、重復(fù)性試驗(yàn)、對比試驗(yàn)和臨床樣本檢測結(jié)果的分析,證實(shí)本試驗(yàn)建立的間接ELISA方法行之有效,可應(yīng)用于臨床檢測。本試驗(yàn)為延邊地區(qū)犬瘟熱病毒疫苗免疫水平的監(jiān)測提供了一種簡便快捷的方法,并為進(jìn)一步研究犬瘟熱病毒H基因的生物學(xué)特性奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：犬瘟熱病毒 H基因 原核表達(dá) ELISA
【學(xué)位授予單位】：延邊大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.65
【目錄】：

• 摘要6-7
• Abstract7-11
• 前言11-20
• 1 犬瘟熱的研究進(jìn)展11-16
• 1.1 犬瘟熱的發(fā)現(xiàn)與流行病學(xué)特點(diǎn)11-12
• 1.2 病原學(xué)12-14
• 1.2.1 犬瘟熱病毒的分類地位12
• 1.2.2 犬瘟熱病毒的形態(tài)和理化特征12
• 1.2.3 犬瘟熱病毒的培養(yǎng)特性12-13
• 1.2.4 犬瘟熱病毒的分子生物學(xué)特征13-14
• 1.3 致病機(jī)理14-15
• 1.4 臨臨床癥狀和病理變化15
• 1.5 免疫防控研究15-16
• 2 犬瘟熱病毒檢測方法的研究進(jìn)展16-19
• 2.1 病毒的分離16
• 2.2 動物回歸試驗(yàn)16
• 2.3 包涵體檢查16-17
• 2.4 電鏡檢查17
• 2.5 免疫學(xué)檢測17-18
• 2.5.1 血清中和試驗(yàn)17
• 2.5.2 免疫組化技術(shù)17-18
• 2.5.3 免疫熒光技術(shù)18
• 2.5.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)18
• 2.5.5 膠體金免疫層析檢測18
• 2.6 分子生物學(xué)檢測18-19
• 2.6.1 核酸雜交技術(shù)18-19
• 2.6.2 RT-PCR技術(shù)19
• 2.6.3 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增19
• 3 研究的目的及意義19-20
• 材料與方法20-36
• 1 材料20-24
• 1.1 病料20
• 1.2 試驗(yàn)動物20
• 1.3 載體20
• 1.4 主要試劑20-21
• 1.5 試驗(yàn)所用溶液及其配制21-23
• 1.5.1 分子克隆所需溶液的配制21
• 1.5.2 瓊脂糖凝膠電泳所需溶液配制21
• 1.5.3 SDS-PAGE電泳所需溶液配制21-22
• 1.5.4 蛋白純化所需溶液配制22-23
• 1.5.5 Western-blot及ELISA所需溶液配制23
• 1.6 主要儀器設(shè)備23-24
• 2 方法24-36
• 2.1 引物的設(shè)計(jì)與合成24
• 2.2 犬瘟熱病毒全基因組RNA的提取24-25
• 2.3 犬瘟熱病毒H基因的擴(kuò)增25
• 2.4 目的基因的純化回收25-26
• 2.5 目的基因的克隆與鑒定26-29
• 2.5.1 CDV-H基因與pMD-18T simple vector連接26-27
• 2.5.2 重組克隆的轉(zhuǎn)化27
• 2.5.3 重組克隆質(zhì)粒的提取27-28
• 2.5.4 重組克隆質(zhì)粒的PCR鑒定28
• 2.5.5 重組質(zhì)粒的酶切鑒定28-29
• 2.5.6 序列測定29
• 2.6 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定29-30
• 2.6.1 目的基因和pGEX-4T-1表達(dá)載體的酶切與回收29
• 2.6.2 目的片段與表達(dá)載體的連接29-30
• 2.6.3 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化及質(zhì)粒的提取30
• 2.6.4 重組表達(dá)質(zhì)粒的PCR鑒定和酶切鑒定30
• 2.6.5 表達(dá)質(zhì)粒的序列測定30
• 2.7 重組表達(dá)蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)30-33
• 2.7.1 重組蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化30-31
• 2.7.2 重組蛋白可溶性分析31
• 2.7.3 重組表達(dá)蛋白的純化31-32
• 2.7.4 重組表達(dá)蛋白的Western-blot分析32
• 2.7.5 多克隆抗體的制備32-33
• 2.7.6 多克隆抗體效價(jià)的檢測33
• 2.8 重組蛋白間接ELISA方法的建立33-36
• 2.8.1 純化抗原最佳包被濃度的篩選與血清最佳稀釋度的篩選33
• 2.8.2 純化抗原最佳包被條件的篩選33-34
• 2.8.3 最適封閉液的篩選和最佳封閉時(shí)間的篩選34
• 2.8.4 血清最佳作用時(shí)間的篩選34
• 2.8.5 酶標(biāo)二抗最佳作用時(shí)間和最佳稀釋度的篩選34
• 2.8.6 底物最適顯色時(shí)間的篩選34
• 2.8.7 陽性和陰性臨界值的確定34-35
• 2.8.8 特異性試驗(yàn)35
• 2.8.9 重復(fù)性試驗(yàn)35
• 2.8.10 間接ELISA方法與免疫膠體金方法的比較試驗(yàn)35
• 2.8.11 臨床樣本檢測35-36
• 結(jié)果36-52
• 1 犬瘟熱病毒H基因的RT-PCR擴(kuò)增36
• 2 pMD18T-CDV-H重組克隆質(zhì)粒的鑒定36-38
• 2.1 重組質(zhì)粒的PCR鑒定36-37
• 2.2 重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定37-38
• 3 重組質(zhì)粒的序列測定及進(jìn)化分析38
• 4 重組質(zhì)粒的PCR鑒定38-40
• 4.1 重組質(zhì)粒的PCR鑒定38-39
• 4.2 重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定39-40
• 5 重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)40
• 6 重組表達(dá)蛋白的可溶性分析40-41
• 7 重組表達(dá)蛋白的純化41-42
• 8 重組表達(dá)蛋白的Western-blot分析42
• 9 多克隆抗體效價(jià)的測定42
• 10 間接ELISA檢測方法的建立42-52
• 10.1 純化抗原最佳包被濃度的篩選與血清最佳稀釋度的篩選42-43
• 10.2 純化抗原最佳包被條件的篩選43-44
• 10.3 最適封閉液的篩選和最佳封閉時(shí)間的篩選44-45
• 10.4 血清最佳作用時(shí)間的篩選45-46
• 10.5 酶標(biāo)二抗最佳作用時(shí)間和最佳稀釋度的篩選46-47
• 10.6 底物最適顯色時(shí)間的篩選47-48
• 10.7 陽性和陰性臨界值的確定48
• 10.8 特異性試驗(yàn)結(jié)果48-49
• 10.9 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果49-50
• 10.10 間接ELISA方法與免疫膠體金方法的比較試驗(yàn)結(jié)果50-51
• 10.11 臨床樣本檢測結(jié)果51-52
• 討論52-56
• 結(jié)論56-57
• 參考文獻(xiàn)57-61
• 致謝61-62
• 作者簡介62

【相似文獻(xiàn)】

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本文編號：429590