煙曲霉是一種重要的條件致病真菌,發(fā)病率僅次于白假絲酵母,位于深部真菌感染第二位。一般來說,煙曲霉感染人體時(shí)主要是以孢子的形式沿呼吸道進(jìn)入肺泡,在肺泡表面存活、定植、萌發(fā),最終向下侵襲生長(zhǎng)入血,引起系統(tǒng)性真菌感染。利用T-DNA及轉(zhuǎn)座子等技術(shù)插入染色體DNA,獲得插入突變體的反向遺傳學(xué)方法,是研究植物、真菌等生物基因功能的一種重要方法。本實(shí)驗(yàn)室前期工作中已建立了煙曲霉T-DNA插入突變體庫,用于煙曲霉基因功能的研究。本研究的主要目的是尋找與煙曲霉生長(zhǎng)繁殖相關(guān)的基因,并研究其與煙曲霉致病力的關(guān)系。經(jīng)篩選獲得形態(tài)改變突變體54株,其中3株表型變化明顯。在研究過程中,確定突變體插入位點(diǎn),明確破壞基因是其關(guān)鍵技術(shù)之一。然而,現(xiàn)有的方法存在操作復(fù)雜,需要限制性內(nèi)切酶酶切及T-A克隆連接等技術(shù)的輔助,陽性率低,有非特異性擴(kuò)增,耗時(shí)長(zhǎng),成本高等缺點(diǎn)。本研究結(jié)合降落PCR、熱不對(duì)稱PCR及抑制PCR技術(shù),建立了一種新型高通量的插入位點(diǎn)分析方法。該方法陽性率高,操作簡(jiǎn)便快捷,節(jié)省時(shí)間、人力及物力。獲得的側(cè)翼序列長(zhǎng)度在300-2500bp之間,可滿足插入位點(diǎn)的生物信息學(xué)分析,為高通量分析插入位點(diǎn)提供技術(shù)支撐...

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【學(xué)位級(jí)別】：博士

【部分圖文】：

圖1.1煙曲霉形態(tài)模式圖

第1章緒論第1章緒論1.1煙曲霉及煙曲霉病的研究進(jìn)展1.1.1煙曲霉及煙曲霉病煙曲霉（Aspergillusfumigatus）是隸屬于半知菌亞門、絲孢綱、絲孢目、絲孢科、曲霉屬的絲狀真菌，在自然環(huán)境中廣泛存在[1]。其在特殊情況下可誘導(dǎo)產(chǎn)生有性世代（Sar....

圖2.1部分突變體hph基因擴(kuò)增結(jié)果

15圖2.1部分突變體hph基因擴(kuò)增結(jié)果Figure2.1PartialmutantshphgeneamplificationresultsDL2000DNAMarker；pBHT1為陽性對(duì)照；None為陰性對(duì)照；其余泳道為不同突變體2.3.3形態(tài)改變煙曲....

圖2.2部分形態(tài)改變突變體菌落形態(tài)

圖2.2部分形態(tài)改變突變體菌落形態(tài)Figure2.2PartialmorphologicalchangesofmutantscolonymorphologPDA培養(yǎng)基，37℃，72h，培養(yǎng)皿直徑9cm

圖3.1快速質(zhì)粒小提試劑盒法提取的pBHT1質(zhì)粒Figure3.1RapidplasmidextractionkitextractedfrompBHT1plasmidM：Trans2KPlusIIDNAMarker；1：提取的pBHT1質(zhì)粒；2、HindIII酶切后的

圖3.1快速質(zhì)粒小提試劑盒法提取的pBHT1質(zhì)粒3.1RapidplasmidextractionkitextractedfrompBHT1PlusIIDNAMarker；1：提取的pBHT1質(zhì)粒；2、HCR法和HI-TAIL法擴(kuò)增質(zhì)粒pBHT....

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