茯苓(Wolfiporia cocos)是我國重要的藥用真菌,其菌核是我國傳統(tǒng)中藥材。茯苓菌核及活性成分形成相關(guān)的功能基因組學(xué)研究對于茯苓產(chǎn)業(yè)發(fā)展非常重要。近年來茯苓基因組測序工作的完成,為其在菌核發(fā)育及活性成分等方面的研究提供了分子信息基礎(chǔ)。然而,茯苓研究中缺乏簡便有效的基因功能鑒定體系。因此,本研究旨在構(gòu)建適用于茯苓基因功能研究的技術(shù)體系,開展的主要研究內(nèi)容及結(jié)果如下:(1)對茯苓內(nèi)源乳清酸核苷-5’-單磷酸脫羧酶基因(URA3)、茯苓甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(GAPDH)啟動子、NADPH氧化酶相關(guān)基因進行了克隆和序列分析,明確了這些基因的序列特征及結(jié)構(gòu)特點。(2)選擇具有潮霉素抗性基因的pCAMBIA1300-g為載體骨架。利用茯苓內(nèi)源乳清酸核苷-5’-單磷酸脫羧酶基因(URA3)作為反向篩選標記,以該基因的功能結(jié)構(gòu)保守區(qū)域的反向互補片段為干擾片段,分別構(gòu)建了以香菇Legpd和Leactin為雙向啟動子的RNAi載體,及以茯苓Wcgpd為單向啟動子的RNAi載體。以茯苓栽培菌株靖州28為試驗材料,首次采用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法侵染茯苓菌絲,經(jīng)5次潮霉素抗性平板篩選后分別獲得了穩(wěn)...

【文章頁數(shù)】：74 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略語表
1 前言
    1.1 茯苓概述
        1.1.1 茯苓的分類地位及形態(tài)
        1.1.2 茯苓的生態(tài)習(xí)性與野生資源分布
        1.1.3 茯苓的食藥用與保健價值
    1.2 茯苓的栽培歷史與現(xiàn)狀
    1.3 茯苓的交配型系統(tǒng)及育種技術(shù)
        1.3.1 茯苓交配型系統(tǒng)
        1.3.2 茯苓育種技術(shù)發(fā)展
    1.4 根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的食用菌遺傳轉(zhuǎn)化的研究
        1.4.1 食用菌遺傳轉(zhuǎn)化體系的研究現(xiàn)狀
        1.4.2 根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法在食用菌中用的啟動子
        1.4.3 根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法在食用菌中常用的篩選標記
        1.4.4 根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法的影響因素
    1.5 RNA干擾技術(shù)在食用菌中的應(yīng)用
        1.5.1 RNA干擾技術(shù)
        1.5.2 RNA干擾在食用菌基因功能研究中的應(yīng)用
    1.6 本研究的目的和意義
2 材料與方法
    2.1 試驗材料
        2.1.1 供試菌株
        2.1.2 主要試劑
        2.1.3 主要儀器
        2.1.4 供試培養(yǎng)基
        2.1.5 引物信息
    2.2 試驗方法
        2.2.1 茯苓遺傳轉(zhuǎn)化相關(guān)基因的克隆及序列分析
        2.2.2 茯苓沉默載體構(gòu)建
        2.2.3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的茯苓遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立
        2.2.4 RNAi轉(zhuǎn)化子的篩選和鑒定
        2.2.5 qRT-PCR分析
        2.2.6 RNAi轉(zhuǎn)化子表型觀測與分析
3 結(jié)果與分析
    3.1 茯苓遺傳轉(zhuǎn)化相關(guān)基因的克隆及序列分析
        3.1.1 茯苓URA3 基因的克隆及序列分析
        3.1.2 茯苓GAPDH基因的克隆及啟動子的序列分析
        3.1.3 茯苓NADPH氧化酶基因Nox-R的克隆及序列分析
    3.2 茯苓菌絲對潮霉素的敏感性試驗
    3.3 茯苓菌絲對頭孢噻肟霉素的敏感性試驗
    3.4 茯苓菌絲對5’-氟-乳清酸的敏感性試驗
    3.5 茯苓URA3 基因的RNAi干擾
        3.5.1 雙向啟動子沉默載體的轉(zhuǎn)化
        3.5.2 單向啟動子沉默載體的轉(zhuǎn)化
    3.6 茯苓Nox-R基因的RNAi干擾
        3.6.1 茯苓Nox-R基因沉默載體的構(gòu)建
        3.6.2 RNAi轉(zhuǎn)化子的篩選與鑒定
        3.6.3 qRT-PCR分析
4 討論
    4.1 香菇雙向啟動子載體沉默效果的評價
    4.2 受體材料的不同培養(yǎng)方式對轉(zhuǎn)化效率的影響
    4.3 茯苓單向啟動子載體沉默效果的評價
    4.4 茯苓基因沉默體系在NADPH氧化酶基因Nox-R中的初步應(yīng)用
5 總結(jié)與展望
參考文獻
附錄
致謝



本文編號：3922674