本文關(guān)鍵詞：高山離子芥基因Cb4773的克隆及其在非生物脅迫中的作用研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：高山離子芥是一種典型的多年生草本植物,屬于十字花科,它可以長期生長在隨時變化的低溫環(huán)境中,主要分布于新疆天山。高山離子芥適應(yīng)低溫的能力很強,可能與體內(nèi)特定基因相關(guān),能及時的應(yīng)對這種惡劣的環(huán)境。目前高山離子芥適應(yīng)低溫環(huán)境的機理仍不清楚。研究這種適應(yīng)低溫環(huán)境的機理,對農(nóng)作物適應(yīng)惡劣環(huán)境及提高產(chǎn)量有幫助作用。本實驗室前期研究表明,高山離子芥果膠甲基酯酶抑制劑基因Cb4773在冷脅迫下表達上升最明顯,可能對高山離子芥適應(yīng)低溫具有重要的功能。本論文克隆高山離子芥基因Cb4773和擬南芥的同源基因At5g62360并過表達擬南芥研究其生物學功能及特征,本文主要研究內(nèi)容與結(jié)果如下:1.通過RACE和Tail-PCR方法,獲得Cb4773基因編碼序列和啟動子區(qū)域序列,編碼區(qū)序列含有591bp,啟動子序列含有1320bp。BLAST對比得到編碼序列與擬南芥基因At5g62360序列在進化關(guān)系中相似度為88%。并分析它們序列和蛋白結(jié)構(gòu)特征,發(fā)現(xiàn)它們含有同功能的PMEI結(jié)構(gòu)域,并基因Cb4773含有跨膜結(jié)構(gòu)域。2.基因Cb4773和At5g62360啟動子序列連接GUS報告基因,GUS組織染色得到它們分別定位在根中、葉片、果莢、花絲和柱頭上。通過Cb4773和At5g62360編碼區(qū)鏈接YFP基因的載體構(gòu)建,通過共聚焦得知亞細胞定位于細胞膜。3.過表達Cb4773和At5g62360基因后,獲得的轉(zhuǎn)基因植株在非生物脅迫下處理,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植物抗凍性和耐鹽性提高。冷馴化后轉(zhuǎn)基因植株的脯氨酸和總糖的含量增加。過表達基因Cb4773和At5g62360及Atpme41突變體都抑制了PME活性。PME活性的抑制造成轉(zhuǎn)基因Cb4773和At5g62360植物早熟,及油菜素內(nèi)酯缺失突變體det2表型恢復(fù),比如根的生長,莖的分枝等。我們實驗得出的這些結(jié)論,在植物以后應(yīng)對非生物脅迫中起到重要的研究意義。實驗中通過RT-PCR結(jié)果得出這兩個基因的表達受到低溫的誘導(dǎo),LT50的測定得出過表達后植株半致死溫度低于野生型,具有更強的抗凍性。此外,過表達這些基因出現(xiàn)的表型在以后的作物提前成熟及培育新品種有極大幫助。
【關(guān)鍵詞】：高山離子芥 擬南芥 果膠甲基酯酶 果膠甲基酯酶抑制劑 果膠 細胞壁 抗凍性
【學位授予單位】：蘭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：Q943.2
【目錄】：

• 中文摘要3-5
• ABSTRACT5-7
• 縮寫詞表7-12
• 第一章 引言12-22
• 1.1 植物細胞壁的組成與結(jié)構(gòu)特征13-14
• 1.2 植物細胞壁果膠的合成及其調(diào)節(jié)14-18
• 1.2.1 PME與PMEI基因家族特征15-17
• 1.2.2 PMEI對PME的作用模式17-18
• 1.3 細胞壁果膠與非生物脅迫之間的關(guān)系18-21
• 1.3.1 PMEI在脅迫作用中的研究進展18
• 1.3.2 植物在鹽脅迫下抗逆性研究18-19
• 1.3.3 植物在冷凍脅迫下抗性研究19-20
• 1.3.4 PMEI與油菜素內(nèi)脂之間的聯(lián)系20-21
• 1.4 高山離子芥耐寒機理研究21-22
• 1.5 本論文的研究目的及意義22
• 第二章 實驗材料和方法22-37
• 2.1 高山離子芥Cb4773基因克隆22-29
• 2.1.1 高山離子芥材料獲取總RNA的提取22-23
• 2.1.2 高山離子芥RNA提取及反轉(zhuǎn)錄23
• 2.1.3 采用 3’RACE and 5’RACE技術(shù)獲得Cb4773基因編碼區(qū)序列23-27
• 2.1.4 采用Tail PCR獲得Cb4773基因 5’UTR上游序列27-29
• 2.2 Gateway技術(shù)構(gòu)建過表達載體及轉(zhuǎn)化29-32
• 2.2.1 實驗材料29
• 2.2.2 目的基因CDS區(qū)PCR擴增29-30
• 2.2.3 構(gòu)建入門克隆及表達載體30-31
• 2.2.4 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株篩選31-32
• 2.3 Gateway技術(shù)構(gòu)建目的基因Promoter::GUS載體及轉(zhuǎn)化32-33
• 2.3.1 基因組DNA提取32
• 2.3.2 目的基因啟動子區(qū)PCR擴增32
• 2.3.3 構(gòu)建入門克隆及表達克隆32-33
• 2.3.4 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株篩選33
• 2.4 Cb4773和At5g62360非生物脅迫表達量檢測33-34
• 2.4.1 實驗材料及處理33
• 2.4.2 實驗方法33-34
• 2.5 轉(zhuǎn)基因植株gus染色34-35
• 2.5.1 實驗中引物設(shè)計34-35
• 2.6 轉(zhuǎn)基因植株耐凍性研究35
• 2.6.1 實驗材料及處理35
• 2.6.2 LT50測定35
• 2.7 轉(zhuǎn)基因植株耐鹽性研究35-36
• 2.7.1 實驗方法及處理35-36
• 2.7.2 植株根長及成活率統(tǒng)計36
• 2.8 PME活性測定36
• 2.9 脯氨酸及總糖含量測定36-37
• 第三章 實驗結(jié)果37-61
• 3.1 高山離子芥Cb4773基因序列獲得及同源性分析37-42
• 3.1.1 3’RACE and 5’RACE技術(shù)克隆獲得Cb4773基因序列37-38
• 3.1.2 序列同源性分析得到擬南芥果膠酯酶抑制酶家族基因38-41
• 3.1.3 編碼區(qū)克隆載體構(gòu)建41-42
• 3.2 啟動子序列獲得及順勢作用元件分析42-44
• 3.2.1 Tail PCR獲取Cb4773啟動子序列42
• 3.2.2 啟動子序列順勢作用元件分析42-44
• 3.2.3 啟動子克隆載體構(gòu)建結(jié)果44
• 3.3 轉(zhuǎn)基因植株是否成功篩選及表達情況鑒定44-45
• 3.4 RT-PCR分析脅迫響應(yīng)情況45-46
• 3.5 Gus組織染色46-48
• 3.6 亞細胞定位48
• 3.7 Cb4773/At5g62360耐受性分析48-55
• 3.7.1 過表達line的RT-PCR分析表達情況48-49
• 3.7.2 過表達Cb4773/At5g62360抗凍性分析49-51
• 3.7.3 過表達Cb4773/At5g62360抗鹽性分析51-55
• 3.8 過表達Cb4773/At5g62360PME活性及生理指標測定55-59
• 3.8.1 過表達Cb4773/At5g62360脯氨酸和總糖測定55-58
• 3.8.2 過表達Cb4773/At5g62360 PME活性測定58-59
• 3.9 轉(zhuǎn)基因Cb4773/At5g62360植株的表型59-60
• 3.10 基因AtPME41部分恢復(fù)det2的表型60-61
• 第四章 討論61-64
• 4.1 基因Cb4773與At5g62360在序列進化比較61
• 4.2 啟動子分析及亞細胞定位61-62
• 4.3 過表達Cb4773和At5g62360提高抗凍性62
• 4.4 過表達Cb4773和At5g62360改變PME活性及影響植物62-63
• 4.5 AtPME41與BR之間的聯(lián)系63-64
• 第五章 結(jié)論及展望64-66
• 5.1 主要結(jié)論64
• 5.2 研究展望64-66
• 參考文獻66-71
• 致謝71

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中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 岳修樂;曲濤;金鳴;徐世健;安黎哲;;低溫脅迫下高山離子芥消減文庫的構(gòu)建[J];蘭州大學學報(自然科學版);2012年06期

2 李玉華;雷志華;趙奇;楊玉珍;;低溫脅迫下24-表油菜素內(nèi)酯對高山離子芥幼苗葉片熒光特性和抗氧化系統(tǒng)的影響[J];鄭州師范教育;2013年02期

3 楊寧;王程亮;陳霞;丁芳霞;李宜s，

本文編號：385364