蔗糖作為光合作用的最初產(chǎn)物,主要通過蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白(Sugar transporter protein,SUT)運輸至不同組織器官,滿足植物生長發(fā)育需要。竹類植物生長迅速,意味著大量光合同化產(chǎn)物從母株到筍的快速運轉(zhuǎn)。雖然SUT基因已經(jīng)在不同物種中得到鑒定,但竹中尚未見SUT基因功能研究的報道。因此,本研究通過RT-PCR分離并克隆得到了一個毛竹SUT基因,通過生物信息學分析、組織表達模式分析、亞細胞定位以及啟動子分析,并結(jié)合轉(zhuǎn)基因功能驗證等實驗,探討毛竹SUT在糖轉(zhuǎn)運、光合作用和次生生長中的功能,為今后利用基因工程技術(shù)改良竹品質(zhì)奠定了基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下:(1)毛竹PhSUT4基因的克隆及組織表達分析。本研究成功克隆1個毛竹蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白基因,全長1791bp,編碼596個氨基酸,屬于SUT2類群;進化樹顯示其與水稻OsSUT4聚為一簇,氨基酸序列對比分析也發(fā)現(xiàn)其與水稻OsSUT4序列相似性較高,故命名為PhSUT4基因。PhSUT4蛋白具有10個結(jié)構(gòu)保守的跨膜結(jié)構(gòu)域和4個磷酸化絲氨酸位點。熒光定量分析(qRT-PCR)其組織表達模式,結(jié)果表明,毛竹PhSUT4基因主要在維管豐富的部位(...

【文章頁數(shù)】：81 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
第一章 緒論
    1.1 研究目的與意義
    1.2 蔗糖轉(zhuǎn)運體SUTs家族研究進展
        1.2.1 SUTs基因的發(fā)現(xiàn)
        1.2.2 SUTs基因的進化
        1.2.3 SUTs的結(jié)構(gòu)
        1.2.4 SUTs具有裝載、運輸和卸載的功能
        1.2.5 糖的運輸與光合作用
        1.2.6 糖的運輸與纖維素合成
    1.3 研究的主要內(nèi)容與技術(shù)路線
        1.3.1 研究的主要內(nèi)容
        1.3.2 技術(shù)路線
第二章 毛竹PhSUT4 基因的克隆及表達分析
    2.1 試驗材料
    2.2 試驗方法
        2.2.1 毛竹PhSUT4 基因的克隆
            2.2.1.1 毛竹葉總RNA的提取
            2.2.1.2 cDNA的合成
            2.2.1.3 毛竹PhSUT4 基因全長克隆
        2.2.2 毛竹PhSUT4 基因的生物信息學分析
            2.2.2.1 高等植物中SUTs蛋白序列進化樹的構(gòu)建
            2.2.2.2 毛竹PhSUT4 蛋白保守型結(jié)構(gòu)域分析
            2.2.2.3 毛竹PhSUT4 基因基本理化性質(zhì)及二級結(jié)構(gòu)分析
            2.2.2.4 毛竹PhSUT4 基因跨膜結(jié)構(gòu)域分析
            2.2.2.5 毛竹PhSUT4 基因的三級結(jié)構(gòu)預測
            2.2.2.6 毛竹PhSUT4 基因磷酸化位點預測
            2.2.2.7 毛竹PhSUT4 基因多重序列比對分析
        2.2.3 毛竹PhSUT4 基因的組織表達分析
            2.2.3.1 組成型組織表達
            2.2.3.2 誘導型組織表達
        2.2.4 毛竹PhSUT4 基因的亞細胞定位分析
            2.2.4.1 構(gòu)建亞細胞定位表達載體
            2.2.4.2 毛竹PhSUT4 基因亞細胞定位擴增序列和Part27 載體質(zhì)粒雙酶切
            2.2.4.3 酶切產(chǎn)物純化回收
            2.2.4.4 毛竹PhSUT4與Part27 表達載體的連接
            2.2.4.5 毛竹 Ph SUT4-Part27 質(zhì)粒雙酶切驗證
            2.2.4.6 基因槍轟擊法轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細胞
    2.3 結(jié)果與分析
        2.3.1 毛竹葉總RNA提取
        2.3.2 毛竹Ph SUT4 基因PCR擴增
        2.3.3 毛竹PhSUT4 基因的大腸桿菌-菌液PCR
        2.3.4 生物信息學分析
            2.3.4.1 高等植物中SUTs蛋白序列系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建
            2.3.4.2 毛竹PhSUT4 蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析
            2.3.4.3 毛竹PhSUT4 基因基本理化性質(zhì)及二級結(jié)構(gòu)分析
            2.3.4.4 毛竹PhSUT4 蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)域分析
            2.3.4.5 毛竹PhSUT4 蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)預測
            2.3.4.6 毛竹PhSUT4 蛋白質(zhì)磷酸化位點預測
            2.3.4.7 毛竹PhSUT4 氨基酸多重序列比對分析
        2.3.5 組織表達分析
            2.3.5.1 毛竹PhSUT4 基因組織表達模式分析
            2.3.5.2 毛竹PhSUT4 基因光響應表達分析
            2.3.5.3 環(huán)境脅迫下毛竹Ph SUT4 基因的表達分析
        2.3.6 亞細胞定位分析
            2.3.6.1 亞細胞定位PCR擴增
            2.3.6.2 毛竹PhSUT4-Part27 質(zhì)粒PCR及質(zhì)粒雙酶切
            2.3.6.3 亞細胞定位分析
    2.4 討論
第三章 毛竹PhpSUT4 啟動子的克隆及表達部位分析
    3.1 試驗材料
    3.2 試驗方法
        3.2.1 毛竹PhpSUT4 啟動子的克隆
            3.2.1.1 引物設計
            3.2.1.2 啟動子序列PCR擴增
            3.2.1.3 PCR回收產(chǎn)物和T載體連接
            3.2.1.4 轉(zhuǎn)化大腸桿菌
            3.2.1.5 大腸桿菌-菌液PCR和質(zhì)粒提取
            3.2.1.6 啟動子質(zhì)粒測序
        3.2.2 啟動子生物信息學分析
            3.2.2.1 毛竹PhpSUT4 啟動子元件分析
        3.2.3 融合質(zhì)粒PhpSUT4：GUS的構(gòu)建
            3.2.3.1 啟動子融合pBI-MCS
            3.2.3.2 毛竹Ph pSUT4-pBI-MCS基因轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌感受態(tài)
            3.2.3.3 啟動子PhpSUT4-pBI-MCS大腸桿菌-菌液PCR
            3.2.3.4 擴大培養(yǎng)并提取質(zhì)粒
        3.2.4 啟動子PhpSUT4-pBI-MCS遺傳轉(zhuǎn)化煙草葉片
            3.2.4.1 啟動子PhpSUT4-pBI-MCS質(zhì)粒轉(zhuǎn)化EHA105 農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞
            3.2.4.2 啟動子PhpSUT4-pBI-MCS農(nóng)桿菌-菌液PCR并擴大培養(yǎng)
            3.2.4.3 啟動子PhpSUT4-pBI-MCS的農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化煙草葉片
            3.2.4.4 pSUT4 啟動子陽性植株的鑒定
        3.2.5 轉(zhuǎn)基因煙草的GUS染色分析
    3.3 結(jié)果與分析
        3.3.1 毛竹PhpSUT4 啟動子的克隆
        3.3.2 毛竹PhpSUT4 啟動子生物信息學分析
        3.3.3 毛竹PhpSUT4-pMD19T及 PhpSUT4-pBI-MCS質(zhì)粒雙酶切
        3.3.4 pSUT4-pMD19T及 p SUT4-pBI-MCS大腸桿菌-菌液PCR
        3.3.5 毛竹PhpSUT4-pBI-MCS遺傳轉(zhuǎn)化小麥愈傷和GUS活性鑒定
        3.3.6 毛竹PhpSUT4 遺傳轉(zhuǎn)化煙草與啟動子表達部位分析
    3.4 討論
第四章 毛竹PhSUT4 基因在煙草生長發(fā)育中的作用
    4.1 試驗材料
    4.2 試驗方法
        4.2.1 構(gòu)建過表達載體
        4.2.2 毛竹PhSUT4-pCAMBIA1303N葉盤法轉(zhuǎn)化煙草
        4.2.3 毛竹PhSUT4-pCAMBIA1303N轉(zhuǎn)基因煙草植株陽性鑒定
        4.2.4 轉(zhuǎn)基因植株相關(guān)指標測定
            4.2.4.1 光合效率的測定
            4.2.4.2 轉(zhuǎn)基因植株葉片葉綠素含量的測定
            4.2.4.3 轉(zhuǎn)基因植株葉片及莖稈可溶性糖含量的測定
            4.2.4.4 轉(zhuǎn)基因植株莖稈可溶性纖維素含量的測定
            4.2.4.5 轉(zhuǎn)基因植株木質(zhì)素含量的測定
            4.2.4.6 轉(zhuǎn)基因植株莖稈顯微觀察
    4.3 結(jié)果與分析
        4.3.1 過表達載體的構(gòu)建
        4.3.2 毛竹PhSUT4-pCAMBIA1303N葉盤法遺傳轉(zhuǎn)化煙草
            4.3.2.1 毛竹PhSUT4-pCAMBIA1303N農(nóng)桿菌PCR
            4.3.2.2 毛竹PhSUT4-pCAMBIA1303N煙草共培養(yǎng)、選擇培養(yǎng)及生根培養(yǎng)
            4.3.2.3 毛竹PhSUT4-pCAMBIA1303N轉(zhuǎn)基因煙草陽性鑒定
            4.3.2.4 PhSUT4-pCAMBIA1303N轉(zhuǎn)基因煙草實時熒光定量分析
        4.3.3 功能分析
            4.3.3.1 PhSUT4 轉(zhuǎn)基因煙草表型變化
            4.3.3.2 轉(zhuǎn)基因植株的光合效率
            4.3.3.3 轉(zhuǎn)基因植株葉綠素含量
            4.3.3.4 過表達Ph SUT4 基因?qū)煵菘扇苄蕴�、纖維素和木質(zhì)素含量的影響
            4.3.3.5 轉(zhuǎn)基因煙草莖稈顯微觀察
    4.4 討論
第五章 毛竹PhSUT4 基因遺傳轉(zhuǎn)化三月竹
    5.1 試驗材料
    5.2 試驗方法
        5.2.1 毛竹PhSUT4 基因遺傳轉(zhuǎn)化三月竹
            5.2.1.1 三月竹未熟種子萌發(fā)
            5.2.1.2 基因槍及農(nóng)桿菌協(xié)同誘導法遺傳轉(zhuǎn)化三月竹
        5.2.2 轉(zhuǎn)基因三月竹陽性驗證
        5.2.3 轉(zhuǎn)基因三月竹PhSUT4 基因表達分析
        5.2.4 轉(zhuǎn)基因三月竹光合效率分析
    5.3 結(jié)果與分析
        5.3.1 毛竹PhSUT4 遺傳轉(zhuǎn)化三月竹
        5.3.2 轉(zhuǎn)基因三月竹陽性鑒定
        5.3.3 轉(zhuǎn)基因三月竹PhSUT4 基因表達量分析
        5.3.4 轉(zhuǎn)基因三月竹光合效率分析
    5.4 討論
結(jié)論
致謝
參考文獻
附錄 研究所用引物序列、藥品及培養(yǎng)基配方和載體圖
攻讀碩士期間發(fā)表的學術(shù)論文及研究成果



本文編號：3838679