發(fā)布時(shí)間：2023-08-03 19:32

　　蔗糖作為光合作用的最初產(chǎn)物,主要通過(guò)蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Sugar transporter protein,SUT)運(yùn)輸至不同組織器官,滿(mǎn)足植物生長(zhǎng)發(fā)育需要。竹類(lèi)植物生長(zhǎng)迅速,意味著大量光合同化產(chǎn)物從母株到筍的快速運(yùn)轉(zhuǎn)。雖然SUT基因已經(jīng)在不同物種中得到鑒定,但竹中尚未見(jiàn)SUT基因功能研究的報(bào)道。因此,本研究通過(guò)RT-PCR分離并克隆得到了一個(gè)毛竹SUT基因,通過(guò)生物信息學(xué)分析、組織表達(dá)模式分析、亞細(xì)胞定位以及啟動(dòng)子分析,并結(jié)合轉(zhuǎn)基因功能驗(yàn)證等實(shí)驗(yàn),探討毛竹SUT在糖轉(zhuǎn)運(yùn)、光合作用和次生生長(zhǎng)中的功能,為今后利用基因工程技術(shù)改良竹品質(zhì)奠定了基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下:(1)毛竹PhSUT4基因的克隆及組織表達(dá)分析。本研究成功克隆1個(gè)毛竹蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因,全長(zhǎng)1791bp,編碼596個(gè)氨基酸,屬于SUT2類(lèi)群;進(jìn)化樹(shù)顯示其與水稻OsSUT4聚為一簇,氨基酸序列對(duì)比分析也發(fā)現(xiàn)其與水稻OsSUT4序列相似性較高,故命名為PhSUT4基因。PhSUT4蛋白具有10個(gè)結(jié)構(gòu)保守的跨膜結(jié)構(gòu)域和4個(gè)磷酸化絲氨酸位點(diǎn)。熒光定量分析(qRT-PCR)其組織表達(dá)模式,結(jié)果表明,毛竹PhSUT4基因主要在維管豐富的部位(...

【文章頁(yè)數(shù)】：81 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
第一章 緒論
    1.1 研究目的與意義
    1.2 蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)體SUTs家族研究進(jìn)展
        1.2.1 SUTs基因的發(fā)現(xiàn)
        1.2.2 SUTs基因的進(jìn)化
        1.2.3 SUTs的結(jié)構(gòu)
        1.2.4 SUTs具有裝載、運(yùn)輸和卸載的功能
        1.2.5 糖的運(yùn)輸與光合作用
        1.2.6 糖的運(yùn)輸與纖維素合成
    1.3 研究的主要內(nèi)容與技術(shù)路線(xiàn)
        1.3.1 研究的主要內(nèi)容
        1.3.2 技術(shù)路線(xiàn)
第二章 毛竹PhSUT4 基因的克隆及表達(dá)分析
    2.1 試驗(yàn)材料
    2.2 試驗(yàn)方法
        2.2.1 毛竹PhSUT4 基因的克隆
            2.2.1.1 毛竹葉總RNA的提取
            2.2.1.2 cDNA的合成
            2.2.1.3 毛竹PhSUT4 基因全長(zhǎng)克隆
        2.2.2 毛竹PhSUT4 基因的生物信息學(xué)分析
            2.2.2.1 高等植物中SUTs蛋白序列進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建
            2.2.2.2 毛竹PhSUT4 蛋白保守型結(jié)構(gòu)域分析
            2.2.2.3 毛竹PhSUT4 基因基本理化性質(zhì)及二級(jí)結(jié)構(gòu)分析
            2.2.2.4 毛竹PhSUT4 基因跨膜結(jié)構(gòu)域分析
            2.2.2.5 毛竹PhSUT4 基因的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)
            2.2.2.6 毛竹PhSUT4 基因磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)
            2.2.2.7 毛竹PhSUT4 基因多重序列比對(duì)分析
        2.2.3 毛竹PhSUT4 基因的組織表達(dá)分析
            2.2.3.1 組成型組織表達(dá)
            2.2.3.2 誘導(dǎo)型組織表達(dá)
        2.2.4 毛竹PhSUT4 基因的亞細(xì)胞定位分析
            2.2.4.1 構(gòu)建亞細(xì)胞定位表達(dá)載體
            2.2.4.2 毛竹PhSUT4 基因亞細(xì)胞定位擴(kuò)增序列和Part27 載體質(zhì)粒雙酶切
            2.2.4.3 酶切產(chǎn)物純化回收
            2.2.4.4 毛竹PhSUT4與Part27 表達(dá)載體的連接
            2.2.4.5 毛竹 Ph SUT4-Part27 質(zhì)粒雙酶切驗(yàn)證
            2.2.4.6 基因槍轟擊法轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細(xì)胞
    2.3 結(jié)果與分析
        2.3.1 毛竹葉總RNA提取
        2.3.2 毛竹Ph SUT4 基因PCR擴(kuò)增
        2.3.3 毛竹PhSUT4 基因的大腸桿菌-菌液PCR
        2.3.4 生物信息學(xué)分析
            2.3.4.1 高等植物中SUTs蛋白序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建
            2.3.4.2 毛竹PhSUT4 蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析
            2.3.4.3 毛竹PhSUT4 基因基本理化性質(zhì)及二級(jí)結(jié)構(gòu)分析
            2.3.4.4 毛竹PhSUT4 蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)域分析
            2.3.4.5 毛竹PhSUT4 蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)
            2.3.4.6 毛竹PhSUT4 蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)
            2.3.4.7 毛竹PhSUT4 氨基酸多重序列比對(duì)分析
        2.3.5 組織表達(dá)分析
            2.3.5.1 毛竹PhSUT4 基因組織表達(dá)模式分析
            2.3.5.2 毛竹PhSUT4 基因光響應(yīng)表達(dá)分析
            2.3.5.3 環(huán)境脅迫下毛竹Ph SUT4 基因的表達(dá)分析
        2.3.6 亞細(xì)胞定位分析
            2.3.6.1 亞細(xì)胞定位PCR擴(kuò)增
            2.3.6.2 毛竹PhSUT4-Part27 質(zhì)粒PCR及質(zhì)粒雙酶切
            2.3.6.3 亞細(xì)胞定位分析
    2.4 討論
第三章 毛竹PhpSUT4 啟動(dòng)子的克隆及表達(dá)部位分析
    3.1 試驗(yàn)材料
    3.2 試驗(yàn)方法
        3.2.1 毛竹PhpSUT4 啟動(dòng)子的克隆
            3.2.1.1 引物設(shè)計(jì)
            3.2.1.2 啟動(dòng)子序列PCR擴(kuò)增
            3.2.1.3 PCR回收產(chǎn)物和T載體連接
            3.2.1.4 轉(zhuǎn)化大腸桿菌
            3.2.1.5 大腸桿菌-菌液PCR和質(zhì)粒提取
            3.2.1.6 啟動(dòng)子質(zhì)粒測(cè)序
        3.2.2 啟動(dòng)子生物信息學(xué)分析
            3.2.2.1 毛竹PhpSUT4 啟動(dòng)子元件分析
        3.2.3 融合質(zhì)粒PhpSUT4：GUS的構(gòu)建
            3.2.3.1 啟動(dòng)子融合pBI-MCS
            3.2.3.2 毛竹Ph pSUT4-pBI-MCS基因轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌感受態(tài)
            3.2.3.3 啟動(dòng)子PhpSUT4-pBI-MCS大腸桿菌-菌液PCR
            3.2.3.4 擴(kuò)大培養(yǎng)并提取質(zhì)粒
        3.2.4 啟動(dòng)子PhpSUT4-pBI-MCS遺傳轉(zhuǎn)化煙草葉片
            3.2.4.1 啟動(dòng)子PhpSUT4-pBI-MCS質(zhì)粒轉(zhuǎn)化EHA105 農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞
            3.2.4.2 啟動(dòng)子PhpSUT4-pBI-MCS農(nóng)桿菌-菌液PCR并擴(kuò)大培養(yǎng)
            3.2.4.3 啟動(dòng)子PhpSUT4-pBI-MCS的農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化煙草葉片
            3.2.4.4 pSUT4 啟動(dòng)子陽(yáng)性植株的鑒定
        3.2.5 轉(zhuǎn)基因煙草的GUS染色分析
    3.3 結(jié)果與分析
        3.3.1 毛竹PhpSUT4 啟動(dòng)子的克隆
        3.3.2 毛竹PhpSUT4 啟動(dòng)子生物信息學(xué)分析
        3.3.3 毛竹PhpSUT4-pMD19T及 PhpSUT4-pBI-MCS質(zhì)粒雙酶切
        3.3.4 pSUT4-pMD19T及 p SUT4-pBI-MCS大腸桿菌-菌液PCR
        3.3.5 毛竹PhpSUT4-pBI-MCS遺傳轉(zhuǎn)化小麥愈傷和GUS活性鑒定
        3.3.6 毛竹PhpSUT4 遺傳轉(zhuǎn)化煙草與啟動(dòng)子表達(dá)部位分析
    3.4 討論
第四章 毛竹PhSUT4 基因在煙草生長(zhǎng)發(fā)育中的作用
    4.1 試驗(yàn)材料
    4.2 試驗(yàn)方法
        4.2.1 構(gòu)建過(guò)表達(dá)載體
        4.2.2 毛竹PhSUT4-pCAMBIA1303N葉盤(pán)法轉(zhuǎn)化煙草
        4.2.3 毛竹PhSUT4-pCAMBIA1303N轉(zhuǎn)基因煙草植株陽(yáng)性鑒定
        4.2.4 轉(zhuǎn)基因植株相關(guān)指標(biāo)測(cè)定
            4.2.4.1 光合效率的測(cè)定
            4.2.4.2 轉(zhuǎn)基因植株葉片葉綠素含量的測(cè)定
            4.2.4.3 轉(zhuǎn)基因植株葉片及莖稈可溶性糖含量的測(cè)定
            4.2.4.4 轉(zhuǎn)基因植株莖稈可溶性纖維素含量的測(cè)定
            4.2.4.5 轉(zhuǎn)基因植株木質(zhì)素含量的測(cè)定
            4.2.4.6 轉(zhuǎn)基因植株莖稈顯微觀察
    4.3 結(jié)果與分析
        4.3.1 過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建
        4.3.2 毛竹PhSUT4-pCAMBIA1303N葉盤(pán)法遺傳轉(zhuǎn)化煙草
            4.3.2.1 毛竹PhSUT4-pCAMBIA1303N農(nóng)桿菌PCR
            4.3.2.2 毛竹PhSUT4-pCAMBIA1303N煙草共培養(yǎng)、選擇培養(yǎng)及生根培養(yǎng)
            4.3.2.3 毛竹PhSUT4-pCAMBIA1303N轉(zhuǎn)基因煙草陽(yáng)性鑒定
            4.3.2.4 PhSUT4-pCAMBIA1303N轉(zhuǎn)基因煙草實(shí)時(shí)熒光定量分析
        4.3.3 功能分析
            4.3.3.1 PhSUT4 轉(zhuǎn)基因煙草表型變化
            4.3.3.2 轉(zhuǎn)基因植株的光合效率
            4.3.3.3 轉(zhuǎn)基因植株葉綠素含量
            4.3.3.4 過(guò)表達(dá)Ph SUT4 基因?qū)煵菘扇苄蕴�、纖維素和木質(zhì)素含量的影響
            4.3.3.5 轉(zhuǎn)基因煙草莖稈顯微觀察
    4.4 討論
第五章 毛竹PhSUT4 基因遺傳轉(zhuǎn)化三月竹
    5.1 試驗(yàn)材料
    5.2 試驗(yàn)方法
        5.2.1 毛竹PhSUT4 基因遺傳轉(zhuǎn)化三月竹
            5.2.1.1 三月竹未熟種子萌發(fā)
            5.2.1.2 基因槍及農(nóng)桿菌協(xié)同誘導(dǎo)法遺傳轉(zhuǎn)化三月竹
        5.2.2 轉(zhuǎn)基因三月竹陽(yáng)性驗(yàn)證
        5.2.3 轉(zhuǎn)基因三月竹PhSUT4 基因表達(dá)分析
        5.2.4 轉(zhuǎn)基因三月竹光合效率分析
    5.3 結(jié)果與分析
        5.3.1 毛竹PhSUT4 遺傳轉(zhuǎn)化三月竹
        5.3.2 轉(zhuǎn)基因三月竹陽(yáng)性鑒定
        5.3.3 轉(zhuǎn)基因三月竹PhSUT4 基因表達(dá)量分析
        5.3.4 轉(zhuǎn)基因三月竹光合效率分析
    5.4 討論
結(jié)論
致謝
參考文獻(xiàn)
附錄 研究所用引物序列、藥品及培養(yǎng)基配方和載體圖
攻讀碩士期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文及研究成果



本文編號(hào)：3838679