畢赤酵母因其在蛋白表達方面的明顯優(yōu)勢,被廣泛用于工業(yè)生產(chǎn)和實驗室研究。近年來,隨著合成生物學的發(fā)展,已有多種藥用化合物或中間體在畢赤酵母中成功合成(如6-甲基水楊酸、土曲霉酸、洛伐他汀等),證明了以畢赤酵母為底盤細胞進行異源多酶途徑組裝從而合成目標分子的應用潛力。由于游離質(zhì)粒在畢赤酵母中不能穩(wěn)定存在,外源基因大多只能通過整合到基因組的方式進行表達。但畢赤酵母同源重組效率低,且篩選標記較少,在復雜遺傳線路設計和多酶途徑組裝時存在設計難度大、構(gòu)建周期長等問題,限制了畢赤酵母的研究和應用。Vogl課題組通過大量實驗探索,在畢赤酵母CBS7435菌株中建立了 CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù),實現(xiàn)了目標基因的敲除和突變,并開發(fā)了一種篩選標記循環(huán)回收使用的方法。此外,一些其他的篩選標記回收方法或多表達盒裝載質(zhì)粒構(gòu)建方法在畢赤酵母中得以開發(fā)應用。但是,在組裝復雜生物合成途徑時,菌株構(gòu)建周期長、設計難度大等問題仍難以解決。本文針對該問題開發(fā)了一套高效、無篩選標記的多基因一步整合方法,為畢赤酵母的基因敲入及重組表達菌株設計提供了新的方法和思路。首先,同源重組在DNA修復的競爭中處于劣勢,Cas9產(chǎn)生...

【文章頁數(shù)】：70 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第1章 文獻綜述
    1.1 畢赤酵母表達系統(tǒng)
        1.1.1 畢赤酵母表達系統(tǒng)的發(fā)展
        1.1.2 畢赤酵母表達系統(tǒng)的應用
        1.1.3 畢赤酵母表達系統(tǒng)的主要問題
    1.2 CRISPR/Cas9系統(tǒng)
        1.2.1 CRISPR技術(shù)研究歷史
        1.2.2 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的組成與作用機制
        1.2.3 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的改造
        1.2.4 CRISPR技術(shù)在畢赤酵母中的應用
    1.3 本課題的研究背景、目的及意義
第2章 畢赤酵母CRISPR/CAS9基因編輯方法的初步建立
    2.1 前言
    2.2 材料與方法
        2.2.1 菌株和質(zhì)粒
        2.2.2 分子生物學試劑和試劑盒
        2.2.3 培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法
        2.2.4 試劑和緩沖溶液
        2.2.5 本章引物及PCR反應
        2.2.6 DNA片段純化及回收
        2.2.7 Overlap PCR
        2.2.8 基因無縫克隆
        2.2.9 大腸桿菌感受態(tài)制備及轉(zhuǎn)化
        2.2.10 畢赤酵母感受態(tài)制備及轉(zhuǎn)化
        2.2.11 酵母基因組的提取
        2.2.12 敲除菌株的PCR驗證
    2.3 結(jié)果與討論
        2.3.1 gRNA-Cas9系列載體構(gòu)建
        2.3.2 供體DNA系列質(zhì)粒構(gòu)建
        2.3.3 畢赤酵母GS115中CRISPR/Cas9基因編輯效果分析
        2.3.4 非同源末端修復機制功能缺陷株Δku70的構(gòu)建與分析
        2.3.5 菌株Δku70中的CRISPR/Cas9的基因編輯效果分析
        2.3.6 本章小結(jié)
第3章 用于CRISPR/CAS9基因編輯的同源重組整合位點篩選與驗證
    3.1 前言
    3.2 材料與方法
    3.3 結(jié)果與討論
        3.3.1 整合位點的選擇與gRNA靶點的設計
        3.3.2 gRNA-Cas9系列質(zhì)粒構(gòu)建
        3.3.3 供體DNA質(zhì)粒構(gòu)建
        3.3.4 不同位點的同源重組效率分析
        3.3.5 組氨酸添加對同源重組效率的影響
        3.3.6 本章小結(jié)
第4章 基于CRISPR/CAS9的畢赤酵母多位點一步整合法的建立與檢驗
    4.1 前言
    4.2 材料與方法
    4.3 結(jié)果與討論
        4.3.1 多RGR體系質(zhì)粒構(gòu)建
        4.3.2 供體DNA質(zhì)粒構(gòu)建
        4.3.3 雙位點整合效率分析
        4.3.4 三位點整合效率分析
        4.3.5 本章小結(jié)
第5章 基于CRISPR/CAS9的畢赤酵母多基因一步整合法的應用檢驗
    5.1 前言
    5.2 材料與方法
        5.2.1 菌株和質(zhì)粒
        5.2.2 搖瓶培養(yǎng)合成產(chǎn)物
        5.2.3 產(chǎn)物萃取與分析
    5.3 結(jié)果與討論
        5.3.1 供體DNA質(zhì)粒構(gòu)建
        5.3.2 雙片段同時整合的酵母菌株篩選
        5.3.3 重組菌株K-NX表達產(chǎn)物分析
        5.3.4 三片段同時整合的酵母菌株篩選
        5.3.5 重組菌株K-NXA表達產(chǎn)物分析
        5.3.6 本章小結(jié)
第6章 結(jié)論與展望
    6.1 結(jié)論
    6.2 創(chuàng)新點
    6.3 展望
參考文獻
致謝
攻讀碩士學位期間撰寫的論文
附錄1 實驗中所用的質(zhì)粒及菌株
附錄2 合成基因序列



本文編號：3826707