畢赤酵母因其在蛋白表達(dá)方面的明顯優(yōu)勢,被廣泛用于工業(yè)生產(chǎn)和實(shí)驗(yàn)室研究。近年來,隨著合成生物學(xué)的發(fā)展,已有多種藥用化合物或中間體在畢赤酵母中成功合成(如6-甲基水楊酸、土曲霉酸、洛伐他汀等),證明了以畢赤酵母為底盤細(xì)胞進(jìn)行異源多酶途徑組裝從而合成目標(biāo)分子的應(yīng)用潛力。由于游離質(zhì)粒在畢赤酵母中不能穩(wěn)定存在,外源基因大多只能通過整合到基因組的方式進(jìn)行表達(dá)。但畢赤酵母同源重組效率低,且篩選標(biāo)記較少,在復(fù)雜遺傳線路設(shè)計(jì)和多酶途徑組裝時(shí)存在設(shè)計(jì)難度大、構(gòu)建周期長等問題,限制了畢赤酵母的研究和應(yīng)用。Vogl課題組通過大量實(shí)驗(yàn)探索,在畢赤酵母CBS7435菌株中建立了 CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù),實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)基因的敲除和突變,并開發(fā)了一種篩選標(biāo)記循環(huán)回收使用的方法。此外,一些其他的篩選標(biāo)記回收方法或多表達(dá)盒裝載質(zhì)粒構(gòu)建方法在畢赤酵母中得以開發(fā)應(yīng)用。但是,在組裝復(fù)雜生物合成途徑時(shí),菌株構(gòu)建周期長、設(shè)計(jì)難度大等問題仍難以解決。本文針對(duì)該問題開發(fā)了一套高效、無篩選標(biāo)記的多基因一步整合方法,為畢赤酵母的基因敲入及重組表達(dá)菌株設(shè)計(jì)提供了新的方法和思路。首先,同源重組在DNA修復(fù)的競爭中處于劣勢,Cas9產(chǎn)生...

【文章頁數(shù)】：70 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第1章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)
        1.1.1 畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的發(fā)展
        1.1.2 畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的應(yīng)用
        1.1.3 畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的主要問題
    1.2 CRISPR/Cas9系統(tǒng)
        1.2.1 CRISPR技術(shù)研究歷史
        1.2.2 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的組成與作用機(jī)制
        1.2.3 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的改造
        1.2.4 CRISPR技術(shù)在畢赤酵母中的應(yīng)用
    1.3 本課題的研究背景、目的及意義
第2章 畢赤酵母CRISPR/CAS9基因編輯方法的初步建立
    2.1 前言
    2.2 材料與方法
        2.2.1 菌株和質(zhì)粒
        2.2.2 分子生物學(xué)試劑和試劑盒
        2.2.3 培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法
        2.2.4 試劑和緩沖溶液
        2.2.5 本章引物及PCR反應(yīng)
        2.2.6 DNA片段純化及回收
        2.2.7 Overlap PCR
        2.2.8 基因無縫克隆
        2.2.9 大腸桿菌感受態(tài)制備及轉(zhuǎn)化
        2.2.10 畢赤酵母感受態(tài)制備及轉(zhuǎn)化
        2.2.11 酵母基因組的提取
        2.2.12 敲除菌株的PCR驗(yàn)證
    2.3 結(jié)果與討論
        2.3.1 gRNA-Cas9系列載體構(gòu)建
        2.3.2 供體DNA系列質(zhì)粒構(gòu)建
        2.3.3 畢赤酵母GS115中CRISPR/Cas9基因編輯效果分析
        2.3.4 非同源末端修復(fù)機(jī)制功能缺陷株Δku70的構(gòu)建與分析
        2.3.5 菌株Δku70中的CRISPR/Cas9的基因編輯效果分析
        2.3.6 本章小結(jié)
第3章 用于CRISPR/CAS9基因編輯的同源重組整合位點(diǎn)篩選與驗(yàn)證
    3.1 前言
    3.2 材料與方法
    3.3 結(jié)果與討論
        3.3.1 整合位點(diǎn)的選擇與gRNA靶點(diǎn)的設(shè)計(jì)
        3.3.2 gRNA-Cas9系列質(zhì)粒構(gòu)建
        3.3.3 供體DNA質(zhì)粒構(gòu)建
        3.3.4 不同位點(diǎn)的同源重組效率分析
        3.3.5 組氨酸添加對(duì)同源重組效率的影響
        3.3.6 本章小結(jié)
第4章 基于CRISPR/CAS9的畢赤酵母多位點(diǎn)一步整合法的建立與檢驗(yàn)
    4.1 前言
    4.2 材料與方法
    4.3 結(jié)果與討論
        4.3.1 多RGR體系質(zhì)粒構(gòu)建
        4.3.2 供體DNA質(zhì)粒構(gòu)建
        4.3.3 雙位點(diǎn)整合效率分析
        4.3.4 三位點(diǎn)整合效率分析
        4.3.5 本章小結(jié)
第5章 基于CRISPR/CAS9的畢赤酵母多基因一步整合法的應(yīng)用檢驗(yàn)
    5.1 前言
    5.2 材料與方法
        5.2.1 菌株和質(zhì)粒
        5.2.2 搖瓶培養(yǎng)合成產(chǎn)物
        5.2.3 產(chǎn)物萃取與分析
    5.3 結(jié)果與討論
        5.3.1 供體DNA質(zhì)粒構(gòu)建
        5.3.2 雙片段同時(shí)整合的酵母菌株篩選
        5.3.3 重組菌株K-NX表達(dá)產(chǎn)物分析
        5.3.4 三片段同時(shí)整合的酵母菌株篩選
        5.3.5 重組菌株K-NXA表達(dá)產(chǎn)物分析
        5.3.6 本章小結(jié)
第6章 結(jié)論與展望
    6.1 結(jié)論
    6.2 創(chuàng)新點(diǎn)
    6.3 展望
參考文獻(xiàn)
致謝
攻讀碩士學(xué)位期間撰寫的論文
附錄1 實(shí)驗(yàn)中所用的質(zhì)粒及菌株
附錄2 合成基因序列



本文編號(hào)：3826707