堿性蛋白酶（alkaline proteases,AprEs）可以水解肽鍵,生成氨基酸或肽類物質(zhì),具有良好的耐熱、耐堿能力,因而廣泛地應(yīng)用于洗滌、制革、紡織、醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域。AprEs應(yīng)用前景廣闊,然而目前對AprEs的研究仍然集中在洗滌劑添加劑方面。因此,挖掘新型AprEs并進一步拓寬其應(yīng)用范圍具有重要的意義。論文從篩選高活性的AprE生產(chǎn)菌株出發(fā),通過分析其基因組,從中挖掘新型的AprE基因?qū)ζ溥M行克隆表達,并研究重組酶的酶學(xué)性質(zhì)及其在手性藥物拆分和牛奶蛋白質(zhì)脫敏中的應(yīng)用,具有一定的意義和價值。論文的主要研究成果如下:（1）對實驗室保藏的芽孢桿菌進行平板初篩,得到4株具有明顯AprE生產(chǎn)能力的菌株;經(jīng)過發(fā)酵培養(yǎng)和酶活測定,得到一株高活性AprE生產(chǎn)菌株W3,酶活高達69.88U·mL^-1,先前已被鑒定和命名為高地芽孢桿菌（Bacillus altitudinis W3）。（2）利用B.altitudinis W3全基因組信息,篩選得到51條蛋白酶基因,其中有9條被初步確定為AprE基因,分別命名為baapr1-9。對這9條AprE基因進行生物信息學(xué)分析與克隆... 

【文章頁數(shù)】：68 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 緒論
    1.1 堿性蛋白酶的概述
        1.1.1 蛋白酶的分類
        1.1.2 堿性蛋白酶的性質(zhì)及分類
        1.1.3 堿性蛋白酶作用機制
        1.1.4 堿性蛋白酶的來源
    1.2 堿性蛋白酶的研究進展
        1.2.1 傳統(tǒng)菌種選育與菌種改良
        1.2.2 異源表達
        1.2.3 基因挖掘
        1.2.4 基因編輯
        1.2.5 蛋白質(zhì)工程
    1.3 堿性蛋白酶的應(yīng)用
        1.3.1 堿性蛋白酶在洗滌行業(yè)中的應(yīng)用
        1.3.2 堿性蛋白酶在制革行業(yè)中的應(yīng)用
        1.3.3 堿性蛋白酶在紡織行業(yè)中的應(yīng)用
        1.3.4 堿性蛋白酶在醫(yī)藥行業(yè)中的應(yīng)用
        1.3.5 堿性蛋白酶在食品行業(yè)中的應(yīng)用
    1.4 論文立題依據(jù)和主要研究內(nèi)容
        1.4.1 論文的立題依據(jù)
        1.4.2 論文的研究內(nèi)容
第二章 材料與方法
    2.1 實驗材料
        2.1.1 菌株與質(zhì)粒
        2.1.2 儀器與設(shè)備
        2.1.3 試劑與材料
        2.1.4 培養(yǎng)基
        2.1.5 溶液和緩沖液
    2.2 實驗方法
        2.2.1 基本檢測方法
        2.2.2 產(chǎn)酶菌株的篩選
        2.2.3 生物信息學(xué)分析
        2.2.4 基因組的提取
        2.2.5 基因的克隆及重組載體的構(gòu)建
        2.2.6 感受態(tài)細胞的制備及重組載體的轉(zhuǎn)化
        2.2.7 重組蛋白的表達及驗證
        2.2.8 生長曲線和酶活曲線的測定
        2.2.9 重組蛋白的分離純化
        2.2.10 酶學(xué)性質(zhì)研究
        2.2.11 手性藥物的拆分與檢測
        2.2.12 牛奶蛋白質(zhì)的水解與檢測
        2.2.13 數(shù)據(jù)分析及繪圖
第三章 結(jié)果與討論
    3.1 菌株的篩選
        3.1.1 初篩
        3.1.2 復(fù)篩
    3.2 生物信息學(xué)分析
        3.2.1 蛋白酶基因的統(tǒng)計與分類
        3.2.2 堿性蛋白酶的初步確定
        3.2.3 堿性蛋白酶的信號肽預(yù)測與分析
        3.2.4 保守結(jié)構(gòu)域分析
    3.3 基因克隆與表達
        3.3.1 堿性蛋白酶在大腸桿菌中的克隆表達
        3.3.2 堿性蛋白酶在枯草芽孢桿菌中的克隆表達
        3.3.3 堿性蛋白酶的異源活性表達
        3.3.4 生長曲線與酶活曲線的測定
        3.3.5 分離純化
        3.3.6 序列比對
    3.4 酶學(xué)性質(zhì)
        3.4.1 最適pH和pH穩(wěn)定性
        3.4.2 最適溫度和溫度穩(wěn)定性
        3.4.3 金屬離子和添加劑
        3.4.4 底物特異性
        3.4.5 動力學(xué)參數(shù)
    3.5 堿性蛋白酶的應(yīng)用
        3.5.1 堿性蛋白酶在手性藥物拆分中的應(yīng)用
        3.5.2 堿性蛋白酶在牛奶蛋白質(zhì)脫敏中的應(yīng)用
主要結(jié)論與展望
    主要結(jié)論
    展望
致謝
參考文獻
附錄1 :作者在攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文
附錄2 :基因序列


【參考文獻】：
期刊論文
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博士論文
[1]三種不同來源（植物、細菌和真菌）蛋白酶的純化、性質(zhì)及應(yīng)用研究[D]. 孫倩.中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 2016
[2]脫毛蛋白酶產(chǎn)生菌的選育及其堿性蛋白酶基因的克隆與表達[D]. 王海燕.四川大學(xué) 2006

碩士論文
[1]CotA漆酶突變體在畢赤酵母中分泌表達及對伊文斯藍降解機制研究[D]. 夏靜.江南大學(xué) 2019
[2]自裂解型人工適體核酶的設(shè)計及其在枯草芽胞桿菌基因表達中的應(yīng)用[D]. 繆勝男.江南大學(xué) 2019
[3]解淀粉芽孢桿菌YP6磷酸酯酶的基因克隆、表達、酶學(xué)性質(zhì)及應(yīng)用[D]. 江威.江南大學(xué) 2018
[4]皮革加工工藝污染物排放特征研究[D]. 趙浩然.黑龍江大學(xué) 2018
[5]堿性蛋白酶的分離純化及其酶學(xué)特性的研究[D]. 楊麗媛.東北師范大學(xué) 2015
[6]高產(chǎn)堿性蛋白酶重組菌及其發(fā)酵性能[D]. 黃文晶.江南大學(xué) 2012
[7]硫（硒）代枯草桿菌蛋白酶水解活力的研究[D]. 李楠.吉林大學(xué) 2010



本文編號：3707179