發(fā)布時間：2022-10-04 15:00

　　日本沼蝦（Macrobrachium nipponense）是我國淡水蝦類養(yǎng)殖業(yè)中重要的養(yǎng)殖品種之一,分布廣泛。環(huán)境脅迫是制約水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的重要因素之一,其中氨氮和亞硝酸鹽是眾多化學(xué)污染脅迫因子中最為普遍,也是對機(jī)體生理功能影響最為顯著的水體脅迫因子。本研究首先對日本沼蝦在亞硝酸鹽脅迫（10.0 mg/L）和氨氮脅迫（22.1 mg/L）下的免疫指標(biāo)進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)肝胰腺作為主要免疫器官,在日本沼蝦抗氨氮和亞硝酸鹽脅迫中具有重要作用,且48小時是關(guān)鍵時間點(diǎn),之后分別進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組實(shí)驗。在亞硝酸鹽脅迫實(shí)驗中,以亞硝酸鹽脅迫和未脅迫48h的日本沼蝦的肝胰腺為研究對象,構(gòu)建3個脅迫和3個未脅迫狀態(tài)下的肝胰腺轉(zhuǎn)錄組文庫;在氨氮脅迫實(shí)驗中,以氨氮脅迫和未脅迫48h的日本沼蝦的肝胰腺為研究對象,構(gòu)建2個脅迫和2個未脅迫狀態(tài)下的肝胰腺轉(zhuǎn)錄組文庫。文庫分別利用高通量測序平臺分析鑒定日本沼蝦肝胰腺中與氨氮和亞硝酸鹽脅迫相關(guān)的差異表達(dá)基因,對脅迫下與免疫相關(guān)通路進(jìn)行分析,并對與免疫應(yīng)答相關(guān)的差異表達(dá)基因進(jìn)行分析驗證。主要研究結(jié)果如下:（1）在濃度為10.0 mg/L亞硝酸鹽脅迫下,肝胰腺、血液、肌肉、... 

【文章頁數(shù)】：121 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
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中文摘要
Abstract
1 前言
    1.1 日本沼蝦及養(yǎng)殖現(xiàn)狀
    1.2 水產(chǎn)養(yǎng)殖中常見環(huán)境脅迫因子的來源與危害
        1.2.1 氨氮的來源和危害
            1.2.1.1 養(yǎng)殖水體中氨氮的來源
            1.2.1.2 氨氮對水生動物的危害
        1.2.2 亞硝酸鹽的來源和危害
            1.2.2.1 水產(chǎn)養(yǎng)殖水體中亞硝酸鹽的來源
            1.2.2.2 亞硝酸鹽對水生動物的危害
        1.2.3 其他環(huán)境因子的來源與危害
    1.3 環(huán)境因子對甲殼動物免疫系統(tǒng)的影響
        1.3.1 氨氮脅迫對甲殼動物免疫系統(tǒng)的影響
        1.3.2 亞硝酸鹽脅迫對甲殼動物免疫系統(tǒng)的影響
        1.3.3 其他環(huán)境因子脅迫對甲殼動物免疫系統(tǒng)的影響
    1.4 常見體液免疫因子
        1.4.1 酚氧化酶
        1.4.2 超氧化物歧化酶
        1.4.3 總抗氧化能力(T-AOC)
    1.5 轉(zhuǎn)錄組
        1.5.1 轉(zhuǎn)錄組學(xué)與基因組學(xué)概述
        1.5.2 轉(zhuǎn)錄組技術(shù)在水產(chǎn)動物上的應(yīng)用
    1.6 研究的目的與意義
2 材料方法
    2.1 試驗材料
        2.1.1 樣品采集
        2.1.2 主要儀器設(shè)備
        2.1.3 試驗耗材
        2.1.4 主要試劑
        2.1.5 常用試劑配制
        2.1.6 主要數(shù)據(jù)庫及生物軟件
    2.2 試驗方法
        2.2.1 免疫指標(biāo)測定方法
            2.2.1.1 總蛋白定量實(shí)驗BCA法
            2.2.1.2 SOD測定
            2.2.1.3 T-AOC測定
            2.2.1.4 PO測定
        2.2.2 總RNA的提取與檢測
        2.2.3 轉(zhuǎn)錄組測序
            2.2.3.1 轉(zhuǎn)錄組建庫測序流程
            2.2.3.2 轉(zhuǎn)錄組文庫構(gòu)建
            2.2.3.3 轉(zhuǎn)錄組文庫上機(jī)測序
        2.2.4 轉(zhuǎn)錄組生物信息分析流程
            2.2.4.1 測序數(shù)據(jù)控制及質(zhì)控
            2.2.4.2 轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)組裝
            2.2.4.3 轉(zhuǎn)錄組基因功能注釋和表達(dá)水平分析
        2.2.5 差異表達(dá)mRNAs的qRT-PCR驗證
            2.2.5.1 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA
            2.2.5.2 差異表達(dá)基因引物合成
            2.2.5.3 差異表達(dá)基因的qRT-PCR
            2.2.5.4 熒光定量PCR數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析
3 結(jié)果與分析
    3.1 亞硝酸鹽脅迫對日本沼蝦免疫指標(biāo)的影響
        3.1.1 亞硝酸鹽脅迫對日本沼蝦SOD活性的影響
        3.1.2 亞硝酸鹽脅迫對日本沼蝦總抗氧化能力的影響
        3.1.3 亞硝酸鹽脅迫對日本沼蝦PO活性的影響
    3.2 氨氮脅迫對日本沼蝦免疫指標(biāo)的影響
        3.2.1 氨氮脅迫對日本沼蝦SOD活性的影響
        3.2.2 氨氮脅迫對日本沼蝦總抗氧化能力的影響
        3.2.3 氨氮脅迫對日本沼蝦PO活性的影響
    3.3 亞硝酸鹽轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果
        3.3.1 RNA質(zhì)量檢測
        3.3.2 原始測序質(zhì)檢情況與測序結(jié)果
        3.3.3 Trinity拼接結(jié)果
        3.3.4 基因功能注釋
        3.3.5 GO分類結(jié)果
        3.3.6 KOG分類結(jié)果
        3.3.7 KEGG分類結(jié)果
        3.3.8 SSR分析
        3.3.9 差異表達(dá)基因分析
            3.3.9.1 差異表達(dá)基因聚類分析
            3.3.9.2 差異基因GO和KEGG通路富集分析
        3.3.10 差異表達(dá)mRNAs qRT-PCR驗證
    3.4 亞硝酸鹽脅迫下免疫應(yīng)答相關(guān)差異表達(dá)基因的篩選與分析
        3.4.1 免疫應(yīng)答相關(guān)差異表達(dá)基因的篩選
        3.4.2 免疫應(yīng)答相關(guān)差異表達(dá)基因的聚類分析
        3.4.3 免疫應(yīng)答相關(guān)差異表達(dá)基因的KEGG分析
        3.4.4 免疫應(yīng)答相關(guān)通路和差異表達(dá)基因的驗證
    3.5 氨氮轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果
        3.5.1 RNA質(zhì)量檢測
        3.5.2 轉(zhuǎn)錄組序列測定與組裝
        3.5.3 生物學(xué)重復(fù)樣品間相關(guān)性檢查
        3.5.4 基因功能注釋
        3.5.5 GO分類結(jié)果
        3.5.6 SNP和Indel分析
        3.5.7 SSR分析
        3.5.8 基因表達(dá)水平分析
        3.5.9 差異基因分析
            3.5.9.1 基因差異表達(dá)分析
            3.5.9.2 差異基因聚類分析
            3.5.9.3 差異基因GO富集分析
            3.5.9.4 差異基因KEGG通路富集分析
        3.5.10 差異表達(dá)基因的qRT-PCR驗證
    3.6 氨氮脅迫下免疫應(yīng)答相關(guān)差異表達(dá)基因篩選與分析
        3.6.1 氮脅迫下免疫應(yīng)答相關(guān)差異表達(dá)基因的篩選
        3.6.2 氮脅迫下免疫應(yīng)答相關(guān)差異表達(dá)基因的聚類分析
        3.6.3 氮脅迫下免疫應(yīng)答相關(guān)差異表達(dá)基因的KEGG分析
        3.6.4 免疫應(yīng)答相關(guān)通路和基因的研究
4 討論
    4.1 氨氮和亞硝酸鹽對免疫指標(biāo)的影響
    4.2 氨氮脅迫對免疫應(yīng)答相關(guān)基因與通路影響
    4.3 亞硝酸鹽脅迫對免疫應(yīng)答相關(guān)基因與通路影響
5 結(jié)論
6 參考文獻(xiàn)
7 致謝
8 攻讀學(xué)位期間發(fā)表論文情況


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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[3]海帶粗多糖對斜帶石斑魚血清指標(biāo)的影響[J]. 李文武,殷光文,林希,黃志堅,林建斌,江和基,朱慶國.  海洋科學(xué). 2015(06)
[4]氨氮脅迫下凡納濱對蝦對副溶血弧菌的易感性[J]. 葛紅星,李健,陳萍,梁忠秀,任海,李東利.  漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展. 2014(06)
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[6]飼料銅含量對亞硝酸鹽脅迫下斑節(jié)對蝦血細(xì)胞的影響[J]. 冼健安,苗玉濤,葉超霞,葉劍敏,郭慧,張勝鵬,王安利.  水生態(tài)學(xué)雜志. 2013(05)
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[10]感染白斑綜合征病毒的斑節(jié)對蝦免疫酶變化特征[J]. 王專偉,黃建華,楊其彬,周發(fā)林,朱彩艷,楊麗詩,江世貴.  湖北農(nóng)業(yè)科學(xué). 2011(09)

碩士論文
[1]斑節(jié)對蝦人工選育及氨氮對其免疫、解毒代謝影響[D]. 李永.上海海洋大學(xué) 2012
[2]不同濃度氨氮、不同低pH突變對克氏原螯蝦免疫功能的影響[D]. 朱毅菲.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2006
[3]環(huán)境脅迫對魚類生理機(jī)能影響的初步研究[D]. 洪磊.中國海洋大學(xué) 2004



本文編號：3685244