本試驗旨在通過CRISPR/Cas9體外酶切法檢測豬生長抑素（SST）基因定點修飾靶點的活性。試驗設(shè)計5個長20bp的單鏈導(dǎo)向RNA（sgRNA）,即SST-sgRNA-g1、SST-sgRNA-g2、SST-sgRNA-g3、SST-sgRNA-g4和SST-sgRNA-g5。化學(xué)合成sgRNA寡核苷酸序列,將寡核苷酸序列連接到可同時表達Cas9和sgRNA的質(zhì)粒中,挑選正確克隆的質(zhì)粒作為模板進行體外轉(zhuǎn)錄形成SST-sgRNA。利用CRISPR/Cas9體外酶切含靶點的DNA片段,根據(jù)酶切條帶的灰度換算成sgRNA活性。結(jié)果顯示目的sgRNA寡核苷酸雙鏈成功插入到質(zhì)粒中且序列正確,以質(zhì)粒為模板體外轉(zhuǎn)錄SST-sgRNA成功。靶位點經(jīng)Cas9蛋白酶切后與標(biāo)準(zhǔn)sgRNA1和sgRNA2酶切活性作比較,確定靶點SST-sgRNA-g1、SST-sgRNA-g4和SST-sgRNA-g5活性較高,可為在細胞水平、胚胎水平做基因定點修飾提供依據(jù)。 

【文章來源】：中國畜牧獸醫(yī). 2016,43(01)北大核心

【文章頁數(shù)】：8 頁

【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1 材料
    1.2 sgRNA靶點選擇及其寡核苷酸鏈的合成
    1.3 sgRNA表達質(zhì)粒構(gòu)建及鑒定
    1.4 sgRNA靶位點活性檢測
        1.4.1 sgRNA PCR產(chǎn)物的獲得
        1.4.2 sgRNA體外轉(zhuǎn)錄
        1.4.3 sgRNA的回收和提取
        1.4.4酶切DNA的獲得
        1.4.5 CRISPR/Cas9體外酶切
2 結(jié)果與分析
    2.1 sgRNA表達質(zhì)粒測序結(jié)果
    2.2 sgRNA體外轉(zhuǎn)錄結(jié)果
    2.3 sgRNA重組質(zhì)粒載體活性檢測
3 討論


【參考文獻】：
期刊論文
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本文編號：3636091