腺病毒介導(dǎo)Tum5重組基因?qū)悄ば律艿囊种?/H1>

發(fā)布時(shí)間：2018-11-21 07:20

【摘要】：研究目的研究腺病毒介導(dǎo)Tum5重組基因過表達(dá)對(duì)生理狀態(tài)下人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells,HUVEC)的增殖、遷移及管腔成形影響;觀察其堿燒傷模型誘導(dǎo)角膜新生血管的抑制作用,并初步探討可能的機(jī)制。研究方法構(gòu)建表達(dá)綠色熒光蛋白(r Ad-GFP)空載體腺病毒和攜帶重組Tum5基因腺病毒載體(r Ad-Tum5),轉(zhuǎn)染HUVEC,在倒置熒光顯微鏡下觀察并計(jì)算其轉(zhuǎn)染效率,用Western blot檢測(cè)Tum5的表達(dá)情況。將HUVEC分為正常對(duì)照組,空載體對(duì)照組(r Ad-GFP組)和Tum5基因組(r Ad-Tum5組);用r Ad-GFP和r Ad-Tum5病毒顆粒(1×1010/ml)分別轉(zhuǎn)染相應(yīng)組別的細(xì)胞,48 h后,采用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(CCK-8)、侵襲小室(Transwell)實(shí)驗(yàn)及基質(zhì)膠(Matrigel)分別檢測(cè)細(xì)胞的增殖、遷移和管腔成形。另外,用人VEGF ELISA試劑盒檢測(cè)轉(zhuǎn)染后24、48、72 h的細(xì)胞上清液中VEGF的含量。通過構(gòu)建大鼠角膜堿燒傷模型研究角膜新生血管。將大鼠分為四組:(1)正常組;(2)生理鹽水組;(3)r Ad-GFP組;(4)r Ad-Tum5。堿燒傷后第1天,在球結(jié)膜下注射20μl r Ad-Tum5、r Ad-GFP病毒注射,堿燒傷組注射等體積的無菌生理鹽水,正常對(duì)照組不做處理。分別于堿燒傷后第7天、第14天摘取大鼠眼球,行石蠟切片,通過HE染色觀察角膜新生血管生長狀況,以及計(jì)數(shù)炎癥細(xì)胞數(shù)目,行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:在燒傷后第1天、第7天、第14天在裂隙燈顯微鏡下觀察大鼠角膜水腫以及新生血管情況,并拍照測(cè)量新生血管面積,行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。研究Tum5對(duì)角膜新生血管的抑制。結(jié)果倒置熒光顯微鏡下可見r Ad-GFP組和r Ad-Tum5組HUVEC細(xì)胞呈清晰的綠色熒光,提示GFP表達(dá),腺病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞成功。經(jīng)定量分析,r Ad-GFP組和r Ad-Tum5組的轉(zhuǎn)染效率分別為55.13%和50.31%。Western blot提示Tum5在體外成功表達(dá)。CCK-8、Transwell及Matrigel實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,正常對(duì)照組、r Ad-GFP組和r Ad-Tum5組細(xì)胞增殖數(shù)量、遷移數(shù)量及管腔成形數(shù)量整體比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=78.914,8.524,226.498,P均0.05)。細(xì)胞增殖數(shù)量、遷移數(shù)量及管腔成形數(shù)量組間兩兩比較結(jié)果顯示,正常對(duì)照組與r Ad-GFP組之間無顯著性差異(P均0.05),而r Ad-Tum5組較正常對(duì)照組、r Ad-GFP組顯著減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均0.05)。ELISA結(jié)果顯示,在腺病毒轉(zhuǎn)染24 h后,三組上清液中VEGF的含量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;在轉(zhuǎn)染48 h和72 h后,Tum5組較正常對(duì)照組、r Ad-GFP組上清液中VEGF含量顯著減少(P均0.05),而正常對(duì)照組與r Ad-GFP組相比,細(xì)胞上清液中VEGF含量在這兩個(gè)時(shí)點(diǎn)均無顯著性差異(P均0.05)。成功構(gòu)建了大鼠角膜堿燒傷模型,HE結(jié)果示:在燒傷后第7天生理鹽水組和r Ad-GFP組炎癥細(xì)胞較r Ad-Tum5組多,燒傷后第14天也是生理鹽水組和r Ad-GFP組角膜間質(zhì)新生血管較r Ad-Tum5多。角膜新生血管面積比較結(jié)果示:各組角膜新生血管面積比較,隨分組和時(shí)間變化均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F分組=2032,p0.01;F時(shí)間=1023,p0.01),第一天各組新生血管面積無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05),第7天r Ad-Tum5組較生理鹽水組和r Ad-GFP組的新生血管面積明顯減少,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05),第14天r Ad-Tum5組較生理鹽水組和r Ad-GFP組新生血管面積也是明顯減少,仍具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。結(jié)論腺病毒介導(dǎo)Tum5在體外能夠高效轉(zhuǎn)染細(xì)胞,并可以成功的表達(dá)。能夠抑制HUVEC細(xì)胞的增殖、遷移和管腔成形。此外,Tum5可以抑制堿燒傷引起的角膜新生血管,其機(jī)制可能與下調(diào)角膜中VEGF表達(dá)有關(guān)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R772.2

【參考文獻(xiàn)】

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2 黃敏麗;羅國容;陳維平;何少健;陳芳;;Tumstatin肽對(duì)視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞增生和遷移的影響[J];眼科新進(jìn)展;2008年09期

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本文編號(hào)：2346298

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