本文關(guān)鍵詞：桑樹花青素生物合成相關(guān)基因的鑒定及功能研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

花青素是一種重要的植物水溶性色素,廣泛分布于多種植物體內(nèi),是形成植物花和果實顏色的主要色素�；ㄇ嗨夭粌H在植物自身生理生化活動中起到重要的作用,而且還具有抗氧化、抗炎癥、抗腫瘤、調(diào)節(jié)血脂等多種生物學(xué)活性�；ㄇ嗨卦诮Y(jié)構(gòu)上屬于類黃酮化合物,其生物合成屬于類黃酮生物合成的一部分,這是一個復(fù)雜的合成途徑,涉及眾多合成基因和調(diào)控基因的參與。目前該途徑已在一些模式植物中被闡明。桑樹是一種多年生木本植物,除了傳統(tǒng)上作為家蠶的食物來源外,桑樹還具有很多其它重要應(yīng)用,包括生態(tài)保護(hù)、中醫(yī)資源、營養(yǎng)保健等。其中桑椹因味道鮮美、營養(yǎng)價值豐富而備受人們青睞。花青素是桑椹中含量豐富的一種營養(yǎng)成分,且具有極高的生物學(xué)活性。目前已有超過11種花青素在桑樹中被鑒定,含量最豐富的分別是矢車菊素-3-O-葡萄糖苷和矢車菊素-3-O-蕓香糖苷。研究桑椹中花青素生物合成途徑對促進(jìn)果桑品質(zhì)改良具有重要意義。本研究利用生物信息學(xué)方法,從桑樹全基因組數(shù)據(jù)庫中鑒定了參與桑樹花青素生物合成的相關(guān)基因,并對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析。同時,我們選取了兩種不同果色的桑樹栽培種材料,利用qRT-PCR研究了所鑒定得到基因在桑椹成熟過程中的轉(zhuǎn)錄水平變化,并利用Western blotting技術(shù)對關(guān)鍵基因所編碼的蛋白表達(dá)情況進(jìn)行了確定,同時結(jié)合UPLC技術(shù)鑒定和測量了桑椹成熟過程中花青素的種類和含量變化,研究了該過程中桑樹花青素生物合成相關(guān)基因的表達(dá)水平與花青素含量之間的關(guān)系。通過構(gòu)建植物表達(dá)載體,利用植物轉(zhuǎn)基因技術(shù),研究了桑樹花青素生物合成關(guān)鍵基因的功能和啟動子活性。本研究所獲得研究結(jié)果如下：1、桑樹花青素生物合成相關(guān)基因的鑒定和信息學(xué)分析利用生物信息學(xué)方法,我們在己測序的川�；蚪M中鑒定得到9個花青素生物合成相關(guān)基因,包括兩個CHS、F3H、F3’H和一個CHl、DFR、ANS,并且以川桑cDNA為模板成功克隆得到除ANS外的其他8個基因(我們在廣東桑品種粵椹大10中克隆得到ANS基因)。在川桑基因組中沒有鑒定到F3’5’H基因�；蚪Y(jié)構(gòu)分析表明,鑒定得到的9個基因全部含有內(nèi)含子,內(nèi)含子數(shù)目和位置與其他植物中報道的相應(yīng)基因的結(jié)果相一致。將鑒定得到的桑樹花青素生物合成相關(guān)基因與其他植物中相對應(yīng)的基因進(jìn)行序列比對發(fā)現(xiàn),除F3H2的序列相似性較低外(小于40%),其余8個基因的序列相似性都較高(65%到93%)。結(jié)構(gòu)域預(yù)測和多序列比對分析表明這些基因所編碼的蛋白質(zhì)都具有保守的行使各自催化活性所需的結(jié)構(gòu)域和活性位點。在plantCARE數(shù)據(jù)庫中對鑒定到的桑樹花青素生物合成相關(guān)基因上游啟動子序列進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)控位點預(yù)測,發(fā)現(xiàn)其主要分為三類,第一類是光響應(yīng)元件,這也是存在數(shù)目最多的一類,如BoxI、G-Box、ATCC-motif等；第二類是一些激素響應(yīng)元件,如ABRE元件響應(yīng)脫落酸反應(yīng)、ERE元件響應(yīng)乙烯反應(yīng)、CGTCA-motif和TGACG-motif響應(yīng)茉莉酸甲酯反應(yīng)等；第三類是一些脅迫響應(yīng)元件,如Box-W1響應(yīng)真菌激發(fā)反應(yīng)、HSE元件響應(yīng)熱脅迫反應(yīng)、LTR元件響應(yīng)低溫脅迫反應(yīng)等。此外,在F3’H1、DFR和ANS上游還分別發(fā)現(xiàn)了MBSI和MBSII元件,這是和類黃酮生物合成相關(guān)的MYB轉(zhuǎn)錄因子的作用位點,這也暗示桑樹MYB轉(zhuǎn)錄因子作為花青素生物合成的調(diào)節(jié)基因?qū)ο嚓P(guān)的結(jié)構(gòu)基因起到調(diào)控作用。2、不同果色桑椹成熟過程中花青素生物合成相關(guān)基因的表達(dá)分析利用qRT-PCR技術(shù)研究了桑樹花青素生物合成相關(guān)基因在川桑六個組織中的表達(dá)情況,結(jié)果表明這些基因的組織表達(dá)模式差別很大,同一基因家族的不同成員之間也表現(xiàn)出很大的差別,例如MnCHSl特異性的在雄花中表達(dá),而MnCHS2主要在根和雌花中表達(dá),并且MnCHSl的表達(dá)水平遠(yuǎn)高于MnCHS2; MnF3Hl主要在根和雄花中表達(dá),而MnF3H2卻主要在莖、葉和雌花中表達(dá)；MnF3’H1特異的在根中表達(dá),而MnF3’H2卻在多個組織中都有表達(dá)。這種表達(dá)差異暗示了同一基因家族中不

同成員之間的功能和調(diào)控上可能存在差異。在川桑六個組織中都沒有檢測到MnANS的表達(dá),這與六個組織中都沒有檢測的花青素積累的結(jié)果相一致。我們選取了兩種不同果色的桑樹品種(紫色果實的粵椹大10和白色果實的珍珠白),首先利用Southern blotting技術(shù)檢測了花青素生物合成相關(guān)基因在川桑和這兩種栽培桑中的拷貝數(shù)情況,結(jié)果表明這些基因在兩種栽培桑中的雜交模式比較一致,并且其拷貝數(shù)比川桑中要多。然后我們利用qRT-PCR技術(shù)研究了桑樹花青素生物合成相關(guān)基因在桑椹成熟過程中的表達(dá)情況,根據(jù)表達(dá)模式的差別將這些基因分為四類,其中Type I類基因包括CHS1、CHl、F3H1、F3’H1和ANS,其在大10中的轉(zhuǎn)錄水平隨著桑椹的成熟而增加,但在珍珠白中幾乎檢測不到表達(dá)。對于花青素生物合成途徑后期的兩個關(guān)鍵基因DFR和ANS,我們通過制備其多克隆抗體,在蛋白水平上進(jìn)一步檢測其表達(dá)情況。Western blotting結(jié)果表明ANS的蛋白水平表達(dá)情況與轉(zhuǎn)錄水平相一致,但DFR卻相反,其轉(zhuǎn)錄水平隨著粵椹大10桑椹的成熟而下降,但蛋白水平卻增加,由此我們推測DFR存在一種轉(zhuǎn)錄水平上的負(fù)反饋調(diào)節(jié)機制。利用UPLC技術(shù)對粵椹大10和珍珠白桑椹成熟過程中的花青素成分進(jìn)行了鑒定和定量,結(jié)果表明粵椹大10桑椹中的花青素主要為矢車菊素-3-O-葡萄糖苷和矢車菊素-3-O-蕓香糖苷,這與之前的研究報道相一致�；ㄇ嗨睾侩S著桑椹的成熟而增加,并且在成熟后期出現(xiàn)急劇的增加,其中矢車菊素-3-O-葡萄糖苷的增加更為明顯。在珍珠白的整個成熟過程中都沒有檢測到花青素的存在。該結(jié)果與花青素生物合成相關(guān)基因的表達(dá)情況相一致。之前關(guān)于桑樹花青素鑒定的研究表明桑樹中的花青素主要為矢車菊素類衍生物和少量的天竺葵素衍生物,本研究中鑒定到的桑樹花青素也主要為矢車菊素類衍生物。分析植物花青素合成途徑可以看出這些不同類型的花青素都是從共同的前體柚皮素合成而來的,在桑樹的基因組中沒有鑒定到F3’5’H基因,F3’5’H是合成翠雀素相關(guān)的基因,推測桑樹中缺乏翠雀素可能是由于F3’5’H基因的缺失所致。另一方面,多序列比對分析表明桑樹的MnDFR屬于Asp類型的DFR,該類DFR不能有效的將二氫山奈酚轉(zhuǎn)化成無色天竺葵素,所以導(dǎo)致桑樹中的花青素主要為矢車菊素類衍生物。3、桑樹花青素生物合成相關(guān)基因的功能研究我們利用植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)在擬南芥中對

MnDFR的啟動子活性進(jìn)行分析,結(jié)果表明在正常生長的轉(zhuǎn)基因擬南芥中,MnDFR的啟動子只在其根部有活性,并且當(dāng)黑暗處理時,其活性會降低,但是當(dāng)進(jìn)行高溫處理后,可誘導(dǎo)其在葉片和葉芽處行使活性,這暗示MnDFR可能參與高溫脅迫引起的反應(yīng)。同樣地,我們將桑樹花青素生物合成途徑后期的兩個關(guān)鍵基因MnDFR和MnANS轉(zhuǎn)化到擬南芥中,觀察其對擬南芥花青素累積的影響。結(jié)果表明與野生型相比,轉(zhuǎn)基因擬南芥從開始抽薹起,其莖的基部表現(xiàn)出明顯的紅色。在莖的生長過程中,整個植株的莖都能表現(xiàn)出淡紅色,并且這種表型變化在轉(zhuǎn)MnANS的植株中更為明顯。這可能是由于在花青素生物合成通路中,ANS是更下游的酶,所以其催化作用對花青素的合成能產(chǎn)生更直接的影響。我們利用葉盤轉(zhuǎn)化法,將除MnANS外的其余8個基因分別轉(zhuǎn)入到煙草中,在煙草中實現(xiàn)目的基因的過量表達(dá)。結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因煙草的生長和表型并沒有出現(xiàn)明顯變化,但是對煙草花朵進(jìn)行花青素提取與定量分析表明,與野生型相比,轉(zhuǎn)基因煙草花朵中的花青素含量出現(xiàn)變化,其中轉(zhuǎn)MnCHS1、MnCHS2、MnCHI和MnDFR煙草植株的花青素含量增加,轉(zhuǎn)MnF3H1和MnF3H2的煙草植株花青素含量出現(xiàn)下降,轉(zhuǎn)MnF3’H1和MnF3’H2的煙草植株的花青素含量沒有明顯變化。本研究利用生物信息學(xué)方法從川�；蚪M中鑒定得到9個花青素生物合成相關(guān)基因,信息學(xué)分析表明與其它植物中相對應(yīng)的基因相比,這些基因在序列、結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)域、催化活性位點上都

存在較高的保守性,暗示了其功能的一致性。在兩種不同果色桑椹成熟過程中的qRT-PCR、Western blotting、UPLC等實驗表明鑒定得到的桑樹花青素生物合成相關(guān)基因的表達(dá)水平與桑椹中花青素的積累密切相關(guān),并且推測出桑樹中F3’5’H基因的缺失和DFR的底物特異性是導(dǎo)致桑樹花青素成分主要為矢車菊素類衍生物的原因。轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灡砻鳟愒幢磉_(dá)桑樹的花青素生物合成相關(guān)基因?qū)煵莺蛿M南芥的花青素累積會產(chǎn)生影響,尤其是在擬南芥中異源表達(dá)MnDFR和MnANS能夠明顯改變其表型。本研究首次在分子生物學(xué)水平上全面研究了桑樹花青素生物合成相關(guān)基因,解析了桑樹花青素成分與生物合成相關(guān)基因之間的關(guān)系。

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