1.目的

    描述外源性DNA殘余量檢定（地高辛法）的操作過程和注意事項。

    2.材料及設備

    2.1試劑試液

    無水乙醇。Tris飽和酚。三氯甲烷。異戊醇。吐溫20。

    20%十二烷基硫酸鈉（SDS）溶液，用鹽酸調(diào)pH至7.2。

    0.2mol/L乙二胺四乙酸二鈉溶液（pH8.0）。3mol/L醋酸鈉溶液。

    20×SSC溶液：0.3mol/L檸檬酸鈉,3mol/LNaCl,調(diào)pH至7.0。

    BufferI(0.lmol/LTris-HCl，0.15mol/LNaCI，用固體NaOH調(diào)pH7.5)。

    BufferⅢ(100mmo1/LTris-HCl100mmo1/LNaCI,50mmo1/LMgCl2，pH9.5)。

    TE緩沖液（pH8.0)：量取1mol/LTris溶液（pH8.0）10ml,0.5mol/LEDTA溶液（pH8.0）

    2ml,加滅菌水至1000ml。

    ECORI內(nèi)切酶（寶生物工程（大連）有限公司）

    BamHI內(nèi)切酶（寶生物工程（大連）有限公司）

    2.2材料和用具

    細菌基因組DNA提取試劑盒（天根生物）批號H6611

    瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（天根生物）批號I7908

    外源DNA殘留量檢測試劑盒（Roche）貨號：11745832910和1109365791

    尼龍膜（PALL0.45微米）

    點樣器（Bio-RAD;ModelNo:Bio-DotSFCell;SerialNo:160BR07680）、移液器、tip頭、恒溫水浴鍋、超凈工作臺、冰盒、離心機、三維旋混儀、電磁爐

    3.操作原理

    用隨機啟動法，將地高辛甙元標記的脫氧尿苷三磷酸摻入未標記DNA，通過一個手臂將dUTP與載體半抗原地高辛甙元連接起來（dig-dUTP）。與目的DNA雜交后，雜交分子用酶聯(lián)免疫法檢測；應用抗體－酶聯(lián)接物（抗地高辛甙元－堿性磷酸酶復合物）和隨后用酶促顏色反應使5－溴－4－氯－3－吲哚磷酸（BCIP）和氮藍四唑（NBT）顯色。

    流程圖

    4.操作過程

    4.1探針制備

    4.1.1提取后的基因組DNA用等體積的飽和酚溶液（飽和酚：三氯甲烷：異戊醇=25：24：1）混合均勻，12000rpm離心（4℃）5分鐘。輕輕吸取上層液體到另一EP管，在上清液中加入1/10體積3mol/L乙酸鈉，稍微震蕩或輕彈混勻，然后加入2倍體積（加入乙酸鈉后的體積）冰無水乙醇，混勻后置于-20℃4小時或-70℃2小時。12000rpm離心（4℃）5分鐘，棄液體，加入70%冰乙醇10000rpm離心（4℃）5分鐘，棄去液體，室溫晾干。加入適量無菌水或TE緩沖液，-20℃保存。

    4.1.2純化后的基因組DNA進行酶切后，進行瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收小片段。取1μg回收DNA用滅菌雙蒸水加至16微升，然后放入沸水浴中將DNA變性，水浴10分鐘后，立即放入冰水浴中，冰浴5分鐘。

    4.1.3冰浴后加入試劑盒中的1#試劑5微升，輕輕搖晃混勻，37℃培養(yǎng)過夜。

    4.1.4次日，將探針取出，向其EP管內(nèi)添加0.2mol/L乙二胺四乙酸二鈉溶液（pH8.0）2微升，3mol/L醋酸鈉溶液2微升，無水乙醇50微升。

    4.1.5將EP管放于-70℃環(huán)境中2小時以上。

    4.1.6取出探針，15000rpm離心（4℃）15分鐘，傾倒上清，用50微升滅菌雙蒸水溶解探針，放于4℃環(huán)境中備用（不宜超過一周）。

    4.2供試品，陽性，陰性及對照處理

    4.2.1用純化后的基因組DNA，稀釋梯度為10ng/100μl、1ng/100μl、100pg/100μl、10pg/100μl，1pg/100μl的陽性對照。陰性對照為稀釋液。

    4.2.2將供試品、陽性對照、陰性對照置100℃水浴加熱10分鐘，迅速冰浴冷卻5分鐘，以8000轉(zhuǎn)/分離心5秒甩水。

    4.3點膜及雜交

    4.3.1用抽濾加樣器將100μl樣品全部點樣于的雜交膜上。

    4.3.2取下雜交膜，點樣面向上，置紫外燈下照射30分鐘。

    4.3.3取無菌培平皿，加10ml已預熱（37℃）雜交液，并將雜交膜全部浸泡于其中，置37℃水浴孵育30分鐘進行預雜交。

    4.3.4預雜交完畢后，倒掉預雜交液加入10ml新鮮預雜交液（50℃）及全部探針（探針置100℃水浴加熱10分鐘，冰浴5分鐘），然后置37℃水浴孵育過夜。

    4.4洗脫及顯色

    4.4.1低嚴謹性洗脫：取無菌培養(yǎng)平皿，加10ml2XSSC（含0.1%SDS）,將雜交膜全部浸泡其中，室溫下置水平脫色搖床，洗２次，每次5分鐘。

    4.4.2高嚴謹性洗脫：取無菌培養(yǎng)平皿，加10ml0.5X(0.1%SDS)(68℃預熱),將雜交液全部浸泡其中，置68℃搖動，洗２次，每次15分鐘。

    4.4.3平衡：取無菌平皿，加10mlBuffer1（含0.3%吐溫20）,將雜交膜全部浸泡其中，室溫下置水平脫色搖床震蕩。

    4.4.4封閉：取一次性無菌培養(yǎng)平皿，加10mlBufferI稀釋過的封閉液，將雜交膜全部浸泡其中，室溫下置水平脫色搖床震蕩30分鐘。

    4.4.5抗體孵育：取一次性無菌培養(yǎng)平皿，加10mlBufferI稀釋過的封閉液，同時加入試劑盒中的4#試劑2微升，將雜交膜全部浸泡其中，室溫下置水平脫色搖床，30分鐘。

    4.4.6洗脫：取一次性無菌培養(yǎng)平皿，加10mlBufferI（0.3％吐溫20）,將雜交膜全部浸泡其中，室溫下置水平脫色搖床，15分鐘，２次。

    4.4.7平衡：取一次性無菌培養(yǎng)平皿，加10mlBufferIII，將雜交膜全部浸泡其中，室溫下置水平脫色搖床，５分鐘。

    4.4.8顯色：取一次性無菌培養(yǎng)平皿，加10mlBufferIII（含200μl5#），將雜交膜全部浸泡其中，室溫下避光靜置0.5小時以上至顯色完畢。

    4.4.9終止反應：將雜交膜置無菌水中５分鐘。

    4.4.10濕膜掃描、風干并封膜。

    5.結果判定

    5.1陽性對照應顯色，其顏色深度與DNA含量相對應，呈一定顏色梯度。

    5.2陰性、空白對照應不顯色，或顯色深度小于陽性DNA對照最低的稀釋度。

    5.3將供試品與陽性對照進行比較，根據(jù)顯色的深淺判定供試品中外源性DNA的含量。