本文關(guān)鍵詞：根癌農(nóng)桿菌介導獲得稗草Ecppc轉(zhuǎn)基因小麥的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

第3期張 彬等:根癌農(nóng)桿菌介導獲得稗草Ecppc轉(zhuǎn)基因小麥的研究 357

水稻、小麥等均為C3植物,較低的光合效率成為限制其單株生物產(chǎn)量進一步提高的重要因素。人們受到C4光合途徑的啟發(fā),希望通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)改造水稻、小麥等C3植物,以增強其葉片的光合能力,從而達到提高光合效率和產(chǎn)量的目的。磷酸烯醇式

丙酮酸羧化酶(PEPC)作為C4光合作用的首要關(guān)鍵酶,一直是研究的熱點。Ku等

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基因小麥的光合速率最大增加39%。農(nóng)桿菌介導植物的轉(zhuǎn)化方法具有導入外源片段完整,插入拷貝數(shù)少,嵌合體比例少的特點。本研究通過根癌農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng),將具有自主知識產(chǎn)權(quán)的稗草PEPCcDNA基因

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(GenBank登錄號:AY251482)導入小

麥,分析影響小麥轉(zhuǎn)化效率的重要因素,研究該基因在小麥基因組中的整合、轉(zhuǎn)錄、翻譯以及表達產(chǎn)物在轉(zhuǎn)基因后代的酶活效應和光合能力,為進一步分析PEPC的過量表達對小麥光合性能的影響提供試驗材料。

首先將玉米PEPC

的完整基因用農(nóng)桿菌介導法導入水稻,獲得了PEPC活性顯著提高的轉(zhuǎn)基因水稻植株,活性最大增加

110倍,PEPC約占總可溶性蛋白的12%。而且與對照相比,轉(zhuǎn)基因植株光合特征也發(fā)生了改變,高濃度氧氣對光合的抑制作用顯著減弱。轉(zhuǎn)基因水稻的光合生理特征已有不少報道,證明轉(zhuǎn)基因水稻具有初級的CO2濃縮機制,在高溫高光強的條件下,氣孔導度、耐光抑制的能力大大增強,凈光合速率提高55%,CO2補償點下降27%,產(chǎn)量最大增加30%。張方等將高粱的ppc基因?qū)胨局?也獲得了光合速率增加的結(jié)果。這些工作表明通過轉(zhuǎn)入ppc基因可以改善作物的光合作用。

目前將ppc基因?qū)胄←湹难芯窟�較少。陳緒清等用基因槍的方法將玉米的ppc基因?qū)胄←?獲得了PEPC活性提高3~5倍的轉(zhuǎn)基因小麥,轉(zhuǎn)

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1 材料和方法

111 供試材料

取不同基因型小麥(TriticumaestivumL1)春性栽培品種Bobwhite、揚麥12和揚麥158幼胚,誘導并篩

選其胚性愈傷組織作為轉(zhuǎn)化的起始外植體材料。112 菌株、質(zhì)粒

根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)LBA4404、EHA105和C58c1為本研究室保存,含稗草磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(Ecppc)的植物表達載體pUb-iEcppc(圖1)由本實驗室構(gòu)建

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。利用凍融法將表。

達載體轉(zhuǎn)入3種根癌農(nóng)桿菌中

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圖1植物表達載體pUb-iEcppc的T-DNA插入?yún)^(qū)結(jié)構(gòu)示意圖

Fig11SchematicmapoftheT-DNAregionofthevectorpUb-iEcppc

P35S:花椰菜花葉病毒35S啟動子;Pubi:玉米泛素基因啟動子;TNOS:胭脂堿合成酶終止子;Hpt:潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因;

Gus:B葡萄糖苷酸酶基因;Ecppc:稗草ppc基因cDNA編碼區(qū)。

P35S:cauliflowermosaicvirus35Spromoter;Pubi:maizeubiquitingenepromoter;TNOS:nopalinesynthasegeneterminator;Gus:B-glucuronidasegene;

Hpt:hygromycinphosphotransferasegene;Ecppc:codingregionofppcgenefromEchinochloacrusgalli1

113 組培轉(zhuǎn)化小麥胚性愈傷組織

挑取小麥胚性愈傷組織,夾碎,于侵染培養(yǎng)基(OD600=018左右)中浸泡,振蕩40min后,棄去菌液,用濾紙將愈傷組織吸干后置于共培養(yǎng)基上,25e避光培養(yǎng)3d。然后將愈傷組織轉(zhuǎn)入洗菌培養(yǎng)基中浸泡30min,用以抑制農(nóng)桿菌生長。用濾紙吸干后25e避光恢復培養(yǎng)1周。再放入篩選培養(yǎng)基中避光篩選,每代12d,連續(xù)篩選2代。經(jīng)過篩選的抗性愈傷組織在繼代培養(yǎng)基中每天光照16h,恢復培養(yǎng)1周后,轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基。試管苗經(jīng)過在壯苗生根培,

移栽到大田中生長至結(jié)實。小麥組織培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化過程中使用的各種培養(yǎng)基見文獻[12-14]。114 轉(zhuǎn)化體的鑒定

11411 轉(zhuǎn)化植株的PCR篩選 取對照和抗性愈

傷組織再生植株(T0代)的幼嫩葉片012g左右,用CTAB法微量提取小麥葉片總DNA

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,用于轉(zhuǎn)化植

株的PCR篩選。用引物Shpt(5c-AAAAAGCCTGAACTCACCGC-3c)和Ahpt(5c-ACTTCTACACAGCCATCG-GT-3c)擴增潮霉素抗性基因,可擴增出1kb的產(chǎn)物,擴增程序為94e3min;94e40s,55e50s,72e130;PCR

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