本文關(guān)鍵詞：同源重組法構(gòu)建多功能農(nóng)藥降解基因工程菌研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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同源重組法構(gòu)建多功能農(nóng)藥降解基因工程菌研究

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蔣建東，顧立鋒，孫紀(jì)全，代先祝，文陽，李順鵬"

4W8*X42A6QI’6B，XYZ2QD,6B，HY*42Q[5A6，I8W\2A6Q]=5，^T*EA6BA63ZWH=56QG,6B"

南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)環(huán)境微生物工程重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，南京

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摘要構(gòu)建遺傳穩(wěn)定的多功能農(nóng)藥降解基因工程菌可以為農(nóng)藥污染的生物修復(fù)提供良好的菌種資源，然而，構(gòu)建遺傳穩(wěn)定

且不帶入外源抗性的基因工程菌是一個(gè)難點(diǎn)。通過以受體菌的"#H/I*8為同源重組指導(dǎo)序列、&+0.基因?yàn)殡p交換正篩選標(biāo)記構(gòu)建同源重組載體，二親結(jié)合的方法將甲基對(duì)硫磷水解酶基因（;?@）整合到呋喃丹降解菌4?"#$1(;($+&>9)JIHQ"染色體的分別成功構(gòu)建了含"個(gè)和!個(gè);?@基因插入到/I*8位點(diǎn)且不帶入外源抗性的基因工程菌株JIHQ-93和JIHQ"#H/I*8位點(diǎn)，

!-93。同源重組單交換的效率為R_7‘"$a7b#_P‘"$a7。通過GJ0和H’5:=,/6雜交的方法驗(yàn)證了同源重組事件�；蚬こ叹z傳穩(wěn)定，能同時(shí)降解甲基對(duì)硫磷和呋喃丹。甲基對(duì)硫磷水解酶（cGM）的比活在各生長(zhǎng)時(shí)期均高于原始出發(fā)菌株，比活最高達(dá)#_!!-5N!B。關(guān)鍵詞

基因工程菌，農(nóng)藥降解，生物修復(fù)同源重組，/I*8，&+0.，

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文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

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中圖分類號(hào)

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國(guó)家“十五”科技攻關(guān)重點(diǎn)項(xiàng)目（*’)!$$KL8%"#8$!）、國(guó)家高技術(shù)發(fā)展計(jì)劃“P#R”（*’)!$$K88!K#$7$、和江蘇省研究生創(chuàng)新計(jì)劃!$$K88!"K"$）項(xiàng)目資助。

蔣建東等：

同源重組法構(gòu)建多功能農(nóng)藥降解基因工程菌研究

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化學(xué)農(nóng)藥是一類重要的環(huán)境異生物（;".-0,-’,/，其在環(huán)境中的生態(tài)學(xué)行為以及修復(fù)一/-&+-2.!3）

［?］

直是國(guó)內(nèi)外研究的重點(diǎn)。目前，科研工作者已經(jīng)分離篩選了大量降解農(nóng)藥的微生物，并成功地將降

［B］解性微生物應(yīng)用于污染環(huán)境的修復(fù)。然而農(nóng)藥品

，它與其它報(bào)道的有機(jī)磷水解酶基因*"#GSJJTUBV）

和*"’-B同源性很低。!"#基因編碼的酶789能夠高效水解78為對(duì)硝基苯酚（8F8）和W，W>二甲基硫

［?B，?J］

代磷酸。789雖然不能完全礦化78，但水解生成的8F8的毒性比78低?XXM?BX倍。呋喃丹的微生物降解研究相對(duì)較少，本實(shí)驗(yàn)室的武俊從活性污泥中分離到一株能夠高效、快速降解呋喃丹的

［?K］鞘氨醇單胞菌&"’(%)*!*%+,3+4Y<L>?，該菌株能完全礦化呋喃丹，通過氣質(zhì)聯(lián)機(jī)分析發(fā)現(xiàn)呋喃丹首

種繁多，環(huán)境中農(nóng)藥污染情況復(fù)雜，降解單一農(nóng)藥的微生物菌株已經(jīng)不能滿足生物修復(fù)的需求，通過生物學(xué)手段構(gòu)建多功能的農(nóng)藥降解基因工程菌株成為

［J，K］

新的研究熱點(diǎn)。

由于質(zhì)粒的不穩(wěn)定性且含有抗性所帶來的環(huán)境釋放潛在風(fēng)險(xiǎn)，將外源基因構(gòu)建于質(zhì)粒載體而獲得的基因工程菌的應(yīng)用越來越受到限制。因此，目前迫切需要發(fā)展一種能將外源目的基因整合到受體菌的染色體上且不帶入抗性的整合系統(tǒng)。盡管依賴于插入序列（DL）介導(dǎo)的整合方法也能獲得遺傳穩(wěn)定的工程菌株，然而，同源重組可以按照人們所預(yù)期的基因位置甚至堿基序列位置進(jìn)行染色體整合而倍受青睞。?@L$EFG基因（$<FG）存在于所有的細(xì)菌中，作為分子進(jìn)化鐘在微生物的系統(tǒng)分類進(jìn)化及分子生態(tài)學(xué)研究中得到了廣泛的應(yīng)用，而且$<FG一般以多拷貝（M?N個(gè)拷貝）的形式存在，因此，若以此作為同源重組整合位點(diǎn)，則會(huì)提高整合幾率，而且不會(huì)因?yàn)椴迦胧Щ畹粢粋�(gè)$<FG操縱元（$$%）而將受體菌致［NO??］死。國(guó)內(nèi)外一般是將克隆到的某個(gè)非致死基因作為同源重組指導(dǎo)序列（9-&-*-#-23E"/-&0,.%’,-.

，而以$<FG為同源重組整<,$"/’,.#L"P2"./"，9E<L）合位點(diǎn)穩(wěn)定表達(dá)外源基因的研究相對(duì)較少。

甲基對(duì)硫磷（78）和呋喃丹為兩種劇毒農(nóng)藥，雖然使用受到限制，但其造成的環(huán)境污染問題仍很嚴(yán)重。世界各地的科研工作者分別從/,01#*!*%+,

屬、.$1-022+屬、32+4*5+-60$(1!屬、72-+2()0%0,屬和本實(shí)驗(yàn)8-’$*5+-6$1!分離篩選到一些78降解菌株，

室的崔中利博士用鳥槍法從78降解菌株從克隆到一個(gè)新的甲基對(duì)硫磷水解酶基因!"#（H".Q%.R

先是斷開氨基甲酸酯鏈，形成呋喃酚，實(shí)驗(yàn)中還檢測(cè)到有紅色中間代謝產(chǎn)物B，K>二叔丁基苯醌的存在，

其余代謝途徑還未見報(bào)道。本文以高效呋喃丹降解菌&"’(%)*!*%+,3+4Y<L>?的?@L$<FG為同源重組位點(diǎn)整合甲基對(duì)硫磷水解酶!"#基因，獲得不帶抗性標(biāo)記的能同時(shí)高效降解78和呋喃丹的工程菌株，為基因工程菌的環(huán)境釋放以及生物修復(fù)應(yīng)用打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，并且為遺傳穩(wěn)定基因工程菌的構(gòu)建提供了一種新的思路與方法。

)

)*)

材料與方法

材料

本實(shí)驗(yàn)中使用的菌株和質(zhì)粒見)*)*)菌株和質(zhì)粒：表?。

限制酶、堿性磷酸酶、)*)*+試劑與試劑盒：5K<FG

連接酶、隨機(jī)引物標(biāo)記試劑盒（E%.!-&8$,&"$<FG

購自大連寶生物工程有限公司=%0"*,.#Z,’["$4B）

（5%Z%E%Q,-’"/(.-*-#)（<%*,%.）Y-4=’!），抗生素購自

江蘇創(chuàng)瑞公司，<FG片段純化回收試劑盒購自其它試劑均為分析純。NX\的78乳H".0%3"公司，

油和VT\呋喃丹原藥分別購自鎮(zhèn)江農(nóng)藥廠和太倉鮑利葛化工有限公司。（標(biāo)記的!Y58購自北>JB8）"京市福瑞生物工程公司；所用引物由大連寶生物工程有限公司合成。

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表!菌株和質(zhì)粒的基本特性

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生物工程學(xué)報(bào)EDD?，‘(*NE8，W(NA

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無機(jī)鹽、!4!45培養(yǎng)基：=Q培養(yǎng)基配方見參考文獻(xiàn)

［8C］；8ZG=Q培養(yǎng)基為稀釋G倍的=Q；=QL培養(yǎng)基中為=Q中添加8DD:Z+=濃度的LU；!=Q培養(yǎng)基中&為=Q中添加?[的蔗糖。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要添加相應(yīng)的抗生素，氨芐青霉素（Y+)）為?D卡那霉素:Z+=，&（R+）為E?鏈霉素（!"#）為8DD:Z+=，:Z+=。&&!46方法!464!

細(xì)菌培養(yǎng)：0*1#,9$1#$)1’2$為=Q培養(yǎng)基GF\

培養(yǎng)，!"#$%&’(’%)*’)456!78為8ZG=Q培養(yǎng)基GD\

培養(yǎng)。

細(xì)菌總6WY的制備、酶!4646分子生物學(xué)操作：

切、酶連、載體脫磷、轉(zhuǎn)化、041’2$普通感受態(tài)制備、質(zhì)粒提取、［8C］；!(1">.#&雜交等操作見參考文獻(xiàn)6WY的回收純化按照試劑盒說明書進(jìn)行；6WY測(cè)序委托大連寶生物公司完成；實(shí)驗(yàn)中所用的引物及U5-擴(kuò)增條件列于表E。

表6引物及789擴(kuò)增條件

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  本文關(guān)鍵詞：同源重組法構(gòu)建多功能農(nóng)藥降解基因工程菌研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。