本文關(guān)鍵詞：廣西六堡茶化學(xué)成分分離、活性分析及茶褐素提取工藝研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

廣西師范學(xué)院碩士學(xué)位論文

第二章 六堡茶不同萃取物的生理活性研究

本章節(jié)主要是針對(duì)廣西六堡茶不同萃取極性部分進(jìn)行活性探究。通過文獻(xiàn)可知黑茶本身含有對(duì)人體有保健作用的功能性成分，六堡茶屬于黑茶之一，因此我們對(duì)其萃取后各極性部分進(jìn)行活性測定。主要分為三部分，分別是測定抗氧化活性、抗菌活性以及抗腫瘤活性。期望通過實(shí)驗(yàn)判定廣西六堡茶中的活性，然后根據(jù)其活性值進(jìn)行提取分離，探究其所含化學(xué)成分。實(shí)驗(yàn)中所用茶葉由廣西梧州茶廠提供。

2.1 實(shí)驗(yàn)儀器和試劑

2.1.1 儀器設(shè)備

表2-1 實(shí)驗(yàn)所用主要儀器

Table 2-1 Main Instrument for Experiment

儀器名稱

標(biāo)準(zhǔn)篩

水浴鍋

循環(huán)水式多用真空泵

酶標(biāo)儀

立式壓力蒸汽滅菌器

離心機(jī)

電熱恒溫干燥箱

高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)

顯微鏡

調(diào)速多用振蕩器

電子天平

CO2培養(yǎng)箱

自動(dòng)三重純水蒸餾器

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀

超聲波清洗機(jī)

手提式高速中藥粉粹機(jī)

廠家 上虞市五四儀器廠 鄭州長城科工貿(mào)有限公司 鄭州長城科工貿(mào)有限公司 Thermo Scientific Company 上海申安醫(yī)療器械廠 湖南湘儀儀器開發(fā)有限公司 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠 上海安亭科學(xué)儀器廠 OLYMPUS,JAPAN 國華電器有限公司 上海梅特勒-托利多有限公司 SANYO Electric CO.,LTD. 上海亞榮生化儀器廠 鄭州長城科工貿(mào)有限公司 鞏義予華儀器有限責(zé)任公司 溫嶺市林大機(jī)械有限公司 型號(hào) 孔徑0.600mm, 60目 WB-2000 SHB-III MLLTISKAN MK3 LDZX-50FB L-535R GZX-DH-400-S-II TGL-16G-C IX2-SLP HY-2 EL-204 INCUBATOR TU-1901 SZ-97A R-1001N KQ-400B DFT-100 雙光束紫外可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司

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2.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

表 2-2 實(shí)驗(yàn)所用主要試劑

Table 2-2 Main Reagent for Experiment

試劑名稱

Vc

MTT

Tris

DPPH

DMSO

蘆丁

石油醚

正丁醇

乙酸乙酯

95%乙醇

H2O2溶液

無水乙醇

鄰苯三酚

鄰二氮菲

鹽酸溶液

PBS緩沖液

胰酶工作液

細(xì)胞凍存液

硫酸亞鐵溶液

10%胎牛血清

F-12培養(yǎng)基

RPMI 1640培養(yǎng)基

普通營養(yǎng)肉湯

胰蛋白胨大豆?fàn)I養(yǎng)肉湯

青霉素-鏈霉素溶液 廠家 上海試四赫維化工有限公司 Sigma Company Amersco Company 上�？笊锛夹g(shù)有限公司 Amersco Company 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司 廣東光華科技股份有限公司 廣東光華科技股份有限公司 廣東光華科技股份有限公司 天津大茂化學(xué)試劑廠 廣東光華化學(xué)廠有限公司 天津大茂化學(xué)試劑廠 天津科密歐化學(xué)試劑廠 上海三愛思試劑有限公司 汕頭市西隴化工廠有限公司 Amresco Company Sigma Company Amresco Company 廣東光華化學(xué)廠有限公司 浙江天杭生物科技有限公司 HyClone Company HyClone Company 北京陸橋技術(shù)公司 北京陸橋技術(shù)公司 Beyotime Company 規(guī)格 AR AR AR AR AR AR AR AR AR AR AR AR AR AR AR AR AR AR AR AR AR AR AR AR AR

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2.2 六堡茶中各極性部分的抗氧化研究

取散裝六堡茶一定量用手提式高速中藥粉粹機(jī)全部粉碎，并用標(biāo)準(zhǔn)篩進(jìn)行篩選備用。稱取兩千克粉碎后的六堡茶粉末，浸泡于95% 乙醇中數(shù)天。過濾浸提液并減壓懸蒸濾液至干，得總浸膏56.2 g。用適量蒸餾水將浸膏溶解，適當(dāng)進(jìn)行超聲，溶解后依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇進(jìn)行萃取，將個(gè)萃取后的提取液減壓濃縮至浸膏，稱量得到石油醚相

9.3785 g，乙酸乙酯相17.9069 g，正丁醇相23.1440 g，水相4.5968 g。各萃取后極性部分分別取適量進(jìn)行抗氧化、抗菌以及抗腫瘤活性測定。

2.2.1 原理和方法

2.2.1.1 DPPH自由基的清除

1,1-二苯基苦基苯肼 (1,1-dipHenyl-2-picrylhydrazyl, DPPH) 是一種穩(wěn)定的自由基，當(dāng)溶解于有機(jī)溶劑如無水乙醇中時(shí)，溶液顯紫色，并且在517 nm的波長下有較強(qiáng)的吸收，配制好的溶液需避光存放。DPPH是含氮原子并含有三個(gè)苯環(huán)的結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)式中氮原子上含有單一電子，可以接受一個(gè)單電子或者氫離子。當(dāng)待測物質(zhì)中含有單電子并與DPPH的氮原子上的單電子配對(duì)時(shí)，溶液顏色變淺，在波長517 nm下的吸收強(qiáng)度降低。溶液的顏色變化和待測物質(zhì)的濃度存在一定的線性關(guān)系，因此我們選擇通過不同濃度的待測物加入DPPH溶液后在517 nm波長下吸光度值的變化來測定物質(zhì)的抗氧化活性[1-7]。

實(shí)驗(yàn)方法：

稱取六堡茶提取液經(jīng)萃取后的各極性部分浸膏和蘆丁及Vc，分別用無水乙醇配制成濃度為1 mg/mL，測量時(shí)分別稀釋至0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL。準(zhǔn)確稱量DPPH 0.0197g，(M=394.32)，用無水乙醇溶解定容至250 mL容量瓶中，得到濃度為2×10-4 mol/L的DPPH溶液，備用，避光冷藏。按表2-3加入溶液進(jìn)行測定

表2-3 DPPH 清除作用加樣表

Table 2-3 Scavenging effect of sample tables

A0 2 mL DPPH + 2 mL 無水乙醇

As 2 mL DPPH + 2 mL 各極性部分浸膏（或?qū)φ諛悠罚?/p>

Aj 2 mL 無水乙醇 + 2 mL 各極性部分浸膏（或?qū)φ諛悠罚?/p>

按表2-3 中加入溶液后充分搖勻，黑暗處靜置30 min，然后以無水乙醇為空白，在517nm 下測定溶液A0、Ai、Aj相對(duì)應(yīng)的吸光度值，根據(jù)清除率公式計(jì)算其清除率值。

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DPPH清除作用的清除率公式：

清除率=[1-(As-Aj)/A0] × 100%

若測定結(jié)果在不同濃度下的清除率基本接近時(shí)，稀釋樣品溶液或者增加DPPH的濃度。然后根據(jù)所測數(shù)據(jù)作圖觀察樣品對(duì)DPPH的清除作用。

2.2.1.2 Fonton反應(yīng)法測定羥基自由基的清除

原理：

依據(jù)文獻(xiàn)方法并相應(yīng)改變后，根據(jù)亞鐵離子催化過氧化氫產(chǎn)生羥基自由基的Fonton反應(yīng)原理，在pH值為2 ~ 9的條件下，鄰二氮菲與亞鐵離子發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)，生成穩(wěn)定的Fe(pHen)32+，反應(yīng)過程中亞鐵離子被氧化成三價(jià)鐵離子，溶液的顏色發(fā)生改變，在特定波長處的吸光度值發(fā)生改變，通過對(duì)吸光度值的測定計(jì)算樣品的清除率[8-13]。

H2O2 + Fe2+ → Fe3+ +·OH + OH -

方法：

(1) 確定最大吸收波長：

移液管量取0.8 mmol/L鄰二氮菲溶液3 mL，PBS緩沖溶液4 mL，去離子水1 mL相繼加入10 mL的具塞比色管中，搖勻，然后加入0.8 mmol/L的硫酸亞鐵溶液1 mL，95%的乙醇1 mL，混勻后在37℃的水浴中溫浴一小時(shí)，用去離子水作為空白對(duì)照，在紫外-可見分光光度計(jì)上190 nm - 800 nm進(jìn)行波譜掃描，據(jù)掃描結(jié)果，確定最大吸收波長為510 nm。

(2) 樣品測定：

移液管量取配置好的0.8 mmol/L的鄰二氮菲溶液3 mL，PBS緩沖溶液4 mL，蒸餾水1 mL，相繼加入10 mL的具塞比色管中，搖勻，加入0.8 mmol/L的硫酸亞鐵溶液1mL，0.01%H2O2溶液1 mL，混勻后在37℃的水浴鍋中溫浴1 h，用蒸餾水做對(duì)照，在510 nm波長下測定吸光度，記為A0；取1 mL無水乙醇代替H2O2加入具塞比色管中，測定吸光度值，記為Ai；然后用移液管量取1 mg/mL的樣品（對(duì)照Vc）溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于具塞比色管中，依次加入0.8、0.6、0.4、0.2、0 mL的去離子水，搖勻，，按Ao 、Ai的方法先后加入鄰二氮菲溶液3 mL，PBS緩沖溶液4 mL，去離子水1 mL，搖勻后加入硫酸亞鐵溶液1 mL，H2O2溶液1 mL，搖勻后于37℃的水浴鍋中溫?zé)? h，在510 nm波長處測定吸光度值，記為Aj。

清除率公式：

清除率=[(Aj-A0)/(Ai-A0)] ×100%

根據(jù)測定的吸光度值作圖觀察清除率作用。

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