本文關(guān)鍵詞：施氏假單胞菌YC-YH1對有機磷農(nóng)藥的降解特性研究

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【摘要】：多年來,在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中我們大量使用有機磷農(nóng)藥,雖然有效保障了糧食果蔬的產(chǎn)量,但也導(dǎo)致了有機磷農(nóng)藥殘留及環(huán)境污染。使得大氣、土壤、水體等環(huán)境都遭到了不同程度的污染,嚴重危害了人類的生命安全。高效清除環(huán)境中殘留的有機磷農(nóng)藥已經(jīng)成為目前研究的熱點。利用微生物降解有機磷農(nóng)藥是一種安全、有效并且廉價的降解有機磷農(nóng)藥的方法,并且因其無殘留、無毒害、無二次污染而受到廣泛關(guān)注。有機磷農(nóng)藥與降解酶結(jié)合發(fā)生酶促反應(yīng)是一個十分快速的過程,但是大部分有機磷降解酶為胞內(nèi)酶,這就使得有機磷進入細胞的過程成為限速步驟,嚴重限制著降解速率。增強菌株對酶的分泌能力能夠很好解決這一問題。本研究以有機磷農(nóng)藥降解菌施氏假單胞菌YC-YH1為實驗材料,從菌株YC-YH1中克隆得到了兩個有機磷降解酶基因mpd和ophc2。將這兩個基因分別連接到表達載體pET-32a上得到重組質(zhì)粒pET-mpd和pET-ophc2,并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中進行表達。甲基對硫磷水解酶(MPH)和有機磷水解酶(OPHC2)分別通過Ni親和層析柱進行純化,并進行了酶學(xué)性質(zhì)分析,研究表明MPH最高活力的反應(yīng)溫度為40℃,在pH 8-12范圍內(nèi),酶均表現(xiàn)出較高的活力;OPHC2的最適反應(yīng)溫度為30℃,在pH 8-12范圍內(nèi)酶活力較高;兩種酶按1:1比例混合組成的混合酶在溫度30℃-40℃范圍內(nèi)酶活力很高,保持在最高酶活力95%以上,混合酶在p H8-12范圍內(nèi)仍具有較高活力;多種金屬離子會對酶活性產(chǎn)生一定影響,酶對SDS和EDTA敏感度很高,混合酶對于金屬離子的敏感性低于單個酶對金屬離子的敏感性。此外,本研究從大腸桿菌中克隆得到TorA雙精氨酸信號肽編碼序列sTorA,構(gòu)建了pHSG299(sTorA-mpd)克隆載體,建立并優(yōu)化施氏假單胞菌的電轉(zhuǎn)化方法,利用電擊轉(zhuǎn)化的方法改造了菌株YC-YH1,并對MPH的周質(zhì)分泌功能進行了測定。實驗結(jié)果表明轉(zhuǎn)化后菌株與野生型菌株相比,胞外酶活力提高36.4%,48 h內(nèi)菌株降解能力提高了8.7%,12h內(nèi)上清液的降解能力提高了44.4%。MPH通過雙精氨酸轉(zhuǎn)運途徑進行周質(zhì)分泌使得菌株對有機磷的降解克服了底物吸收限制。MPH的周質(zhì)分泌使得菌株降解能力提高,這對污染環(huán)境的生物修復(fù)和有機磷農(nóng)藥工業(yè)廢水處理有著十分重要的意義。
【關(guān)鍵詞】：有機磷農(nóng)藥 施氏假單胞菌 有機磷水解酶 酶學(xué)性質(zhì) 雙精氨酸系統(tǒng)
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：X172;X592
【目錄】：

• 摘要6-7
• Abstract7-13
• 第一章 引言13-21
• 1.1 有機磷農(nóng)藥13-15
• 1.1.1 有機磷農(nóng)藥的發(fā)展概況13
• 1.1.2 有機磷農(nóng)藥作用機理13-14
• 1.1.3 有機磷農(nóng)藥的污染及危害14-15
• 1.2 有機磷農(nóng)藥的微生物降解15-17
• 1.2.1 有機磷農(nóng)藥降解方法15-16
• 1.2.2 有機磷農(nóng)藥降解菌16
• 1.2.3 有機磷農(nóng)藥降解酶16-17
• 1.3 細菌分泌系統(tǒng)17-20
• 1.3.1 常見的分泌途徑17-18
• 1.3.2 雙精氨酸蛋白轉(zhuǎn)運途徑18-20
• 1.4 研究目的和意義20-21
• 第二章 施氏假單胞菌YC-YH1降解酶基因克隆表達21-34
• 2.1 實驗材料21-22
• 2.1.1 主要試劑耗材、菌株及載體21
• 2.1.2 培養(yǎng)基及相關(guān)溶液21-22
• 2.1.3 主要儀器22
• 2.2 實驗方法22-28
• 2.2.1 菌株基因組DNA提取22
• 2.2.2 降解酶基因的獲得22-24
• 2.2.3 載體構(gòu)建24-26
• 2.2.4 mpd和ophc2基因的誘導(dǎo)表達及蛋白純化26-28
• 2.2.5 MPH和OPHC2的比較分析28
• 2.3 結(jié)果與分析28-33
• 2.3.1 基因組DNA提取28
• 2.3.2 克隆得到mpd和ophc2基因28-29
• 2.3.3 構(gòu)建得到pET-mpd和pET-ophc229-30
• 2.3.4 蛋白質(zhì)表達純化30-31
• 2.3.5 MPH和OPHC2的比較分析31-33
• 2.4 討論33-34
• 第三章 菌株YC-YH1降解酶的酶活性質(zhì)分析34-40
• 3.1 實驗材料34
• 3.1.1 試劑與材料34
• 3.1.2 主要儀器34
• 3.2 實驗方法34-35
• 3.2.1 蛋白質(zhì)定量34
• 3.2.2 對硝基苯酚標準曲線的制作34
• 3.2.3 酶的活性測定34
• 3.2.4 酶學(xué)性質(zhì)的測定34-35
• 3.2.5 降解甲基對硫磷的動力學(xué)分析35
• 3.3 結(jié)果與分析35-39
• 3.3.1 蛋白質(zhì)定量35-36
• 3.3.2 對硝基苯酚標準曲線36
• 3.3.3 酶學(xué)性質(zhì)的研究36-39
• 3.4 討論39-40
• 第四章 菌株YC-YH1利用Tat系統(tǒng)分泌MPH載體構(gòu)建40-49
• 4.1 實驗材料40
• 4.1.1 主要試劑及菌株、載體40
• 4.1.2 主要儀器40
• 4.2 實驗方法40-45
• 4.2.1 MPH的定位40-41
• 4.2.2 菌株基因組DNA提取41-42
• 4.2.3 重組質(zhì)粒構(gòu)建42-44
• 4.2.4 菌株YC-YH1生長曲線測定44-45
• 4.2.5 YC-YH1菌株感受態(tài)細胞的制備45
• 4.2.6 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進入菌株YC-YH145
• 4.3 結(jié)果與分析45-48
• 4.3.1 MPH的定位45-46
• 4.3.2 菌株YC-YH1生長曲線46-47
• 4.3.3 重組質(zhì)粒的獲得47-48
• 4.3.4 轉(zhuǎn)化菌株的獲得48
• 4.4 討論48-49
• 第五章 菌株YC-YH1利用Tat系統(tǒng)分泌MPH能力測定49-55
• 5.1 實驗材料49
• 5.1.1 試劑與材料49
• 5.1.2 主要儀器49
• 5.2 實驗方法49-50
• 5.2.1 菌株YC-YH1(sTorA-mpd)生長曲線測定49
• 5.2.2 毒死蜱標準曲線的制作49-50
• 5.2.3 降解毒死蜱能力測定50
• 5.2.4 酶活力測定50
• 5.2.5 蛋白含量測定50
• 5.3 結(jié)果與分析50-54
• 5.3.1 菌株YC-YH1(sTorA-mpd)生長曲線50-51
• 5.3.2 毒死蜱標準曲線51-52
• 5.3.3 解毒死蜱能力測定52-53
• 5.3.4 酶活力測定53
• 5.3.5 蛋白含量測定53-54
• 5.4 討論54-55
• 第六章 結(jié)論55-56
• 6.1 研究結(jié)果55
• 6.2 創(chuàng)新點55
• 6.3 展望55-56
• 參考文獻56-62
• 致謝62-63
• 作者簡歷63

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本文編號：984788