本文關(guān)鍵詞：核受體PPARγ組裝DNA折紙色譜藥物篩選模型的構(gòu)建及應(yīng)用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：藥物篩選模型是尋找和發(fā)現(xiàn)新藥的重要方法之一。近年來,隨著分子生物學(xué)、藥學(xué)及現(xiàn)代色譜技術(shù)等學(xué)科的迅猛發(fā)展,涌現(xiàn)出大量新型的藥物篩選模型。這些新型藥物篩選模型具有篩選方法簡便、篩選過程迅速,并且可以實(shí)現(xiàn)高通量篩選等特點(diǎn)。近幾年,DNA折紙技術(shù)的發(fā)展及應(yīng)用越來越成熟,DNA折紙主要的優(yōu)點(diǎn)包括具有空間可尋址、生物相容性好、制備過程簡單及表面易于修飾等。本文擬利用DNA折紙以上的特點(diǎn),將其作為生物載體把核受體PPARγ負(fù)載在其表面,然后采用化學(xué)鍵合的方法將二者的綴合物共價鍵合在無機(jī)材料硅膠表面,最后將硅膠填充于不銹鋼色譜柱中,從而構(gòu)建一種新型基于DNA折紙色譜的藥物篩選模型。首先,以Ecoil. JM109為噬菌體M13 mp18的宿主,通過聚乙二醇沉淀純化,采用酚抽提得到M13 mp18 ssDNA,采用瓊脂糖凝膠對其進(jìn)行表征；以BL21 (DE3)菌為PPARγ-LBD蛋白的表達(dá)菌株,進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)、提取、及純化得到PPARγ-LBD蛋白,采用SDS-PAGE電泳對其進(jìn)行表征；在PCR儀中采用特定的程序,以M13mp18 ssDNA為腳手架鏈,在訂書釘鏈的輔助下,組裝得到DNA折紙結(jié)構(gòu)；DNA折紙結(jié)構(gòu)表面的“捕獲鏈”與PPARγ蛋白表面修飾的DNA鏈通過堿基互補(bǔ)配對將PPARγ組裝到DNA折紙表面,采用瓊脂糖凝膠電泳和AFM對其進(jìn)行表征;以SMCC為交聯(lián)劑,將PPARγ-DNA折紙綴合物鍵合到巰丙基硅膠表面,得到核受體PPARγ組裝DNA折紙色譜固定相；將此固定相裝填于不銹鋼色譜柱中,完成核受體PPARγ組裝DNA折紙色譜藥物篩選模型的構(gòu)建。其次,本文對核受體PPARγ組裝DNA折紙色譜藥物篩選模型的親和性和特異性進(jìn)行了評價。以未組裝核受體PPARγ的色譜柱為陰性對照柱,觀察陽性藥物羅格列酮在陰性對照柱和核受體PPARγ組裝DNA折紙色譜柱上的保留行為,對本研究構(gòu)建的藥物篩選模型的親和性進(jìn)行評價；以撲熱息痛為陰性藥物,羅格列酮為陽性藥物,觀察二者在核受體PPARγ組裝DNA折紙色譜柱上的保留行為,對本研究構(gòu)建的藥物篩選模型的特異性進(jìn)行評價。結(jié)果表明,核受體PPARγ組裝DNA折紙藥物篩選模型能夠?qū)傩缘刈R別羅格列酮。再次,研究核受體PPARγ組裝DNA折紙色譜藥物篩選模型在中藥人參活性成分篩選中的應(yīng)用。采用PPARγ組裝DNA折紙色譜柱分析人參總皂苷,分別收集有保留的組分和未保留的組分。利用反相色譜分別對人參總皂苷、人參皂苷與PPARγ相互作用并且作用能力較強(qiáng)的組分主要是人參皂苷Re。最后,本文對核受體PPARγ組裝DNA折紙色譜藥物篩選模型的重復(fù)性和穩(wěn)定性進(jìn)行了考察。隨機(jī)選擇三批核受體PPARγ組裝DNA折紙色譜固定相并裝填成色譜柱,觀察人參皂苷在三批色譜柱上的保留行為,以此來評價核受體PPARγ組裝DNA折紙色譜藥物篩選模型的重復(fù)性,人參皂苷的分析色譜圖基本一致,說明本研究構(gòu)建的藥物篩選模型重復(fù)性良好：通過觀察人參皂苷在同一色譜柱上的保留行為,來考察核受體PPARγ組裝DNA折紙色譜藥物篩選模型的穩(wěn)定性,隨著分析時間的延長,人參皂苷的保留時間減短且峰形變窄,說明本研究構(gòu)建的藥物篩選模型的穩(wěn)定性有待進(jìn)一步優(yōu)化。
【關(guān)鍵詞】：藥物篩選模型 DNA折紙 人參皂苷 HPLC
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：X703
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-12
• 第一章 前言12-20
• 1 藥物篩選模型的研究進(jìn)展12-13
• 2 過氧化物酶增殖物激活受體13-15
• 2.1 PPARγ的結(jié)構(gòu)及配體13-14
• 2.2 PPARγ的功能14-15
• 3 DNA折紙納米結(jié)構(gòu)的研究進(jìn)展及其應(yīng)用15-18
• 3.1 DNA折紙納米結(jié)構(gòu)的研究進(jìn)展15-17
• 3.2 DNA折紙納米結(jié)構(gòu)的應(yīng)用17-18
• 4 本研究的選題依據(jù)及意義18-20
• 第二章 核受體PPARγ組裝DNA折紙色譜藥物篩選模型的建立20-43
• 第一節(jié) M13mp18 ssDNA的制備20-26
• 1 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑21-22
• 1.1 實(shí)驗(yàn)儀器21
• 1.2 實(shí)驗(yàn)試劑21-22
• 2 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容22-26
• 2.1 溶液的配制及處理22-23
• 2.2 M13mp18 ssDNA的制備23-25
• 2.3 M13mp18 ssDNA的表征25-26
• 3 總結(jié)26
• 第二節(jié) hPPARγ-LBD重組蛋白的表達(dá)、提取及純化26-31
• 1 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑26-28
• 1.1 實(shí)驗(yàn)儀器26
• 1.2 實(shí)驗(yàn)試劑26-28
• 2 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容28-31
• 2.1 溶液的配制及處理28
• 2.2 重組hPPARγ-LBD的表達(dá)及提取28-29
• 2.3 hPPARγ-LBD重組蛋白的純化29-31
• 3 總結(jié)31
• 第三節(jié) DNA折紙組裝核受體PPARγ的制備31-37
• 1 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑32
• 1.1 實(shí)驗(yàn)儀器32
• 1.2 實(shí)驗(yàn)試劑32
• 2 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容32-37
• 2.1 溶液的配制及處理32-33
• 2.2 DNA折紙結(jié)構(gòu)的組裝33-34
• 2.3 DNA-hPPARγ-LBD的制備34-35
• 2.4 hPPARγ-LBD組裝DNA折紙的制備35
• 2.5 DNA折紙結(jié)構(gòu)及DNA-hPPARγ-LBD的表征35-37
• 3 總結(jié)37
• 第四節(jié) 巰丙基硅膠的制備37-40
• 1 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑38
• 1.1 實(shí)驗(yàn)儀器38
• 1.2 實(shí)驗(yàn)試劑38
• 2 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容38-39
• 2.1 硅膠的預(yù)處理38
• 2.2 巰丙基硅膠的合成及純化38-39
• 2.3 巰丙基硅膠的表征39
• 3 總結(jié)39-40
• 第五節(jié) 核受體PPARγ組裝DNA折紙色譜柱的研制40-43
• 1 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑40-41
• 1.1 實(shí)驗(yàn)儀器40
• 1.2 實(shí)驗(yàn)試劑40-41
• 2 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容41-42
• 2.1 核受體PPARγ組裝DNA折紙色譜固定相的制備41
• 2.2 不銹鋼空柱管的預(yù)處理41
• 2.3 勻漿液的制備41
• 2.4 核受體PPARγ組裝DNA折紙色譜柱的裝填41-42
• 3 總結(jié)42-43
• 第三章 核受體PPARγ組裝DNA折紙色譜藥物篩選模型的評價及應(yīng)用43-55
• 第一節(jié) 核受體PPARγ組裝DNA折紙色譜藥物篩選模型的評價43-47
• 1 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑43
• 1.1 實(shí)驗(yàn)儀器43
• 1.2 實(shí)驗(yàn)試劑43
• 2 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容43-46
• 2.1 溶液的配制及處理43-44
• 2.2 核受體PPARγ組裝DNA折紙色譜柱的預(yù)處理44
• 2.3 色譜條件44-45
• 2.4 核受體PPARγ組裝DNA折紙色譜藥物篩選模型的評價45-46
• 3 總結(jié)46-47
• 第二節(jié) 核受體PPARγ組裝DNA折紙色譜藥物篩選模型在篩選中藥人參活性成分中的應(yīng)用47-51
• 1 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑47
• 1.1 實(shí)驗(yàn)儀器47
• 1.2 實(shí)驗(yàn)試劑47
• 2 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容47-50
• 2.1 溶液的配制及處理47-48
• 2.2 篩選中藥人參中活性成分48-50
• 3 結(jié)論50-51
• 第三節(jié) 核受體PPARγ組裝DNA折紙色譜藥物篩選模型重復(fù)性和穩(wěn)定性的考察51-55
• 1 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑51
• 1.1 實(shí)驗(yàn)儀器51
• 1.2 實(shí)驗(yàn)試劑51
• 2 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容51-54
• 2.1 溶液的配制及處理51-52
• 2.2 色譜條件52
• 2.3 藥物篩選模型的重復(fù)性考察52-53
• 2.4 藥物篩選模型的穩(wěn)定性考察53-54
• 3 總結(jié)54-55
• 全文總結(jié)55-57
• 參考文獻(xiàn)57-60
• 附錄60-61
• 個人簡歷61-62
• 碩士期間發(fā)表論文62-63
• 致謝63

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本文編號：439978