N-乙酰葡萄糖胺是一種具有多種生物活性的單糖,廣泛應用于食品、藥品及化妝品行業(yè)。酶法降解幾丁質(zhì)生產(chǎn)N-乙酰葡萄糖胺因其工藝條件溫和,綠色環(huán)保,具有很好的發(fā)展前景。黑曲霉菌絲體作為發(fā)酵工業(yè)廢棄物是一種廉價且具有安全性的幾丁質(zhì)原料,因此針對黑曲霉菌絲體進行酶法生產(chǎn)N-乙酰葡萄糖胺工藝的探索具有較高的研究與應用價值。本文以酶法水解黑曲霉菌絲體為出發(fā)點,克隆表達并表征了一種來自黑曲霉的幾丁質(zhì)酶AnChi,并對AnChi在生產(chǎn)中的應用進行了探索。本論文包括以下研究內(nèi)容:(1)通過序列比對與同源模建分析對AnChi的功能進行預測,發(fā)現(xiàn)其具有高度保守的GH18家族幾丁質(zhì)酶結(jié)構(gòu),推測其具有幾丁質(zhì)酶活性,而且底物親和力較低。(2)構(gòu)建了大腸桿菌表達質(zhì)粒pET-28a-AnChi并成功轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3),使用IPTG誘導表達得到C端含有組氨酸標簽的AnChi,通過金屬螯合層析分離純化,得到高純度的AnChi,表達量可達到40 mg/L。(3)對AnChi的酶學性質(zhì)進行表征,測得最適溫度40℃,最適pH為6.0,同時測得其對4-MU-β-(GlcNAc)₂與乙二醇幾丁質(zhì)的...

【文章頁數(shù)】：55 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
引言
1 綜述
    1.1 N-乙酰葡萄糖胺的應用
        1.1.1 N-乙酰葡萄糖胺
        1.1.2 N-乙酰葡萄糖胺的應用
    1.2 N-乙酰葡萄糖胺的生產(chǎn)原料
    1.3 N-乙酰葡萄糖胺的制備方法
        1.3.1 化學方法生產(chǎn)GlcNAc
        1.3.2 酶催化法生產(chǎn)
        1.3.3 酶法生產(chǎn)GlcNAc的改良工藝
        1.3.4 生物轉(zhuǎn)化法
    1.4 N-乙酰葡萄糖胺生產(chǎn)過程中的酶
        1.4.1 GH18家族幾丁質(zhì)酶
        1.4.2 GH19家族幾丁質(zhì)酶
        1.4.3 GH20家族N-乙酰己糖胺酶
    1.5 選題依據(jù)與研究內(nèi)容
        1.5.1 選題依據(jù)
        1.5.2 研究內(nèi)容
2 AnChi的氨基酸序列分析
    2.1 引言
    2.2 實驗材料與方法
    2.3 實驗結(jié)果與討論
        2.3.1 氨基酸序列比對分析
        2.3.2 同源模建分析
    2.4 小結(jié)
3 AnChi的重組表達、分離純化與性質(zhì)表征
    3.1 引言
    3.2 實驗材料與方法
        3.2.1 實驗材料
        3.2.2 pET-28a-AnChi表達載體的構(gòu)建
        3.2.3 AnChi在大腸桿菌中的重組表達
        3.2.4 AnChi的分離純化
        3.2.5 AnChi的酶學性質(zhì)表征
        3.2.6 AnChi對復雜底物的水解實驗
    3.3 實驗結(jié)果與討論
        3.3.1 質(zhì)粒pET-28a-AnChi的構(gòu)建與表達
        3.3.2 質(zhì)粒pET-28a-AnChi’的構(gòu)建與表達
        3.3.3 AnChi的分離與純化
        3.3.4 AnChi的酶學性質(zhì)表征
        3.3.5 AnChi的復雜底物水解實驗
    3.4 小結(jié)
4 AnChi在枯草芽孢桿菌中的重組表達及應用
    4.1 引言
    4.2 實驗材料與方法
        4.2.1 實驗材料
        4.2.2 pDG1663-AnChi表達載體的構(gòu)建
        4.2.3 AnChi在枯草芽孢桿菌中的重組表達
        4.2.4 AnChi的粗分離與鑒定
        4.2.5 AnChi粗酶液對菌絲體的水解實驗
        4.2.6 AnChi水解菌絲體的產(chǎn)物鑒定與純化
        4.2.7 AnChi粗酶液的底物富集實驗
    4.3 實驗結(jié)果與討論
        4.3.1 pDG1663-AnChi表達載體的構(gòu)建
        4.3.2 AnChi在枯草芽孢桿菌中的重組表達與優(yōu)化
        4.3.3 枯草芽孢桿菌發(fā)酵液粗分離與AnChi的鑒定
        4.3.4 AnChi粗酶液對菌絲體的水解實驗
        4.3.5 AnChi的底物富集實驗
    4.4 小結(jié)
結(jié)論
展望
參考文獻
附錄 AnChi的DNA序列與編碼氨基酸序列
攻讀碩士學位期間發(fā)表學術論文情況
致謝



本文編號：3902318