深色有隔內(nèi)生真菌(Dark septate endophytes,DSE)是一類廣泛定殖于植物根內(nèi)的內(nèi)生真菌。實驗室前期分離得到了一株重金屬高度耐受的DSE菌株嗜魚外瓶霉(Exophialapisciphila,H93),轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)Cd2+脅迫上調(diào)了褪黑素合成酶基因(TDC、SNAT、ASMT)的表達。褪黑素(Melatonin)是一種古老的抗氧化小分子,在提高生物體的重金屬脅迫耐性上發(fā)揮著重要作用。為探究H93菌株中褪黑素與重金屬耐性之間的聯(lián)系,首先利用施加外源褪黑素的方式探究褪黑素介導H93菌株的重金屬耐性;然后對H93菌株褪黑素合成酶基因進行生物信息分析;探討在重金屬(Cd2+、Cu2+、Zn2+、Pb2+)脅迫下H93菌株褪黑素合成水平及其合成酶基因的響應(yīng)模式;用大腸桿菌誘導表達體系對H93兩個褪黑素合成酶基因EpTDC、EpASMT進行了誘導表達以獲取其酶活特征,構(gòu)建了E這TDC、EpASMT大腸桿菌和擬南芥過表達株,以異源過表達的方式研究了褪黑素合成酶基因與重金屬耐性之間的關(guān)系及可能的機制。研究主要結(jié)果如下:1.外源褪黑素主要通過調(diào)控H93重金屬吸收和轉(zhuǎn)運系統(tǒng)、或直接鰲...

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【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 研究背景
    1 深色有隔內(nèi)生真菌嗜魚外瓶霉(Exophiala pisciphila,H93)重金屬耐性
    2 褪黑素與重金屬耐性
    3 褪黑素的生物合成途徑
    4 褪黑素的合成調(diào)控
    5 本文主要研究內(nèi)容及意義
    6 技術(shù)路線
第二章 外源褪黑素的施加對H93重金屬耐性的影響
    1 前言
    2 材料和方法
        2.1 菌株
        2.2 主要儀器設(shè)備、試劑
        2.3 培養(yǎng)基及試劑的配制
            2.3.1 培養(yǎng)基的配制
            2.3.2 溶液的配制
        2.4 實驗方法
            2.4.1 菌株的培養(yǎng)及收集
            2.4.2 重金屬含量的測定
            2.4.3 SOD、MDA、OFR和蛋白質(zhì)含量的測定
        2.5 數(shù)據(jù)處理與分析
    3 結(jié)果分析
        3.1 Cd²⁺脅迫下H93中Cd、SOD、MDA、OFR積累特征
        3.2 Cu²⁺脅迫下H93中Cu²⁺、SOD、MDA、OFR積累特征
        3.3 Zn²⁺脅迫下H93中Zn²⁺、SOD、MDA、OFR積累特征
        3.4 Pb²⁺脅迫下H93中Pb²⁺、SOD、MDA、OFR積累特征
    4 討論
第三章 褪黑素合成酶(EpTDC、EpSNAT、EpASMT)生物信息學分析
    1 前言
    2 材料和方法
    3 結(jié)果分析
        3.1 褪黑素合成酶基因保守結(jié)構(gòu)域分析
        3.2 蛋白質(zhì)親疏水性分析
        3.3 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預測
        3.4 信號肽預測分析
        3.5 蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預測
        3.6 亞細胞定位分析
        3.7 褪黑素合成酶基因進化分析
    4 討論
第四章 H93褪黑素及其合成酶基因?qū)Σ煌亟饘倜{迫的響應(yīng)
    1 前言
    2 材料與方法
        2.1 菌株
        2.2 主要儀器設(shè)備、試劑
        2.3 試劑的配制
        2.4 實驗方法
            2.4.1 H93菌株的培養(yǎng)
            2.4.2 H93褪黑素的含量測定
            2.4.3 H93總RNA的提取
            2.4.4 cDNA反轉(zhuǎn)錄
            2.4.5 熒光定量PCR引物的設(shè)計
            2.4.6 熒光定量PCR
        2.5 實驗數(shù)據(jù)的分析
    3 結(jié)果分析
        3.1 Cd²⁺脅迫下不同時間,H93褪黑素含量及TDC、SNAT、ASMT表達量的響應(yīng)分析
        3.2 Cu²⁺脅迫下不同時間,H93褪黑素含量及TDC、SNAT、ASMT表達量的響應(yīng)分析
        3.3 Zn²⁺脅迫下不同時間,H93褪黑素含量及TDC、SNAT、ASMT表達量的響應(yīng)分析
        3.4 Pb²⁺脅迫下不同時間,H93褪黑素含量及TDC、SNAT、 ASMT表達量的響應(yīng)分析
    4 討論
第五章 H93褪黑素合成酶基因蛋白表達分析
    1 前言
    2 材料和方法
        2.1 菌株與質(zhì)粒
        2.2 主要儀器設(shè)備、試劑
        2.3 培養(yǎng)基與試劑的配制
        2.4 實驗方法
            2.4.1 TDC、ASMT基因的克隆
                2.4.1.1 H93cDNA模板第一條鏈的合成
                2.4.1.2 TDC、ASMT擴增引物
                2.4.1.3 EpTDC、EpASMT PCR擴增
                2.4.1.4 TDC、ASMT PCR產(chǎn)物的回收和檢測
                2.4.1.5 產(chǎn)物連接克隆載體
                2.4.1.6 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
                2.4.1.7 陽性克隆的篩選與鑒定
            2.4.2 TDC、ASMT的誘導表達
                2.4.2.1 含有TDC、ASMT片段的pMD-18T克隆質(zhì)粒的提取
                2.4.2.2 含酶切位點的EpTDC、EpASMT的擴增
                2.4.2.3 質(zhì)粒雙酶切
                2.4.2.4 酶切產(chǎn)物的連接
                2.4.2.5 表達載體轉(zhuǎn)化BL21(DE3)
                2.4.2.6 蛋白質(zhì)的誘導表達
                2.4.2.7 SDS-PAGE檢測
            2.4.3 酶活性分析
                2.4.3.1 粗酶的提取
                2.4.3.2 酶促反應(yīng)
                2.4.3.3 HPLC分析
        2.5 數(shù)據(jù)處理與分析
    3 實驗結(jié)果
        3.1 EpTDC、EpASMT擴增結(jié)果
        3.2 表達載體酶切驗證結(jié)果
        3.3 蛋白誘導表達結(jié)果
        3.4 粗酶催化結(jié)果
    4 討論
第六章 大腸桿菌、擬南芥異源表達EpTDC、EpASMT重金屬耐性分析
    1 前言
    2 材料和方法
        2.1 菌株、質(zhì)粒及擬南芥種子
        2.2 主要儀器設(shè)備、試劑
        2.3 培養(yǎng)基的配法
        2.4 實驗方法
            2.4.1 不同重金屬脅迫下,EpTDC、EpASMT大腸桿菌異源過表達株生物量的測定
            2.4.2 植物表達載體的構(gòu)建
                2.4.2.1 含酶切位點EpTDC、EpASMT的PCR擴增
                2.4.2.2 質(zhì)粒的雙酶切
            2.4.3 根癌農(nóng)桿菌感受態(tài)制備
            2.4.4 根癌農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化
            2.4.5 根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化擬南芥
                2.4.5.1 擬南芥的種植
                2.4.5.2 擬南芥的轉(zhuǎn)化
                2.4.5.3 擬南芥抗性苗的篩選與鑒定
            2.4.6 擬南芥轉(zhuǎn)化株平板重金屬耐性實驗
            2.4.7 擬南芥轉(zhuǎn)化株Cd²⁺含量的測定
        2.5 數(shù)據(jù)處理與分析
    3 實驗結(jié)果
        3.1 擬南芥表達載體的酶切驗證
        3.2 轉(zhuǎn)基因擬南芥植株P(guān)CR驗證結(jié)果
        3.3 重金屬脅迫下,大腸桿菌過表達株生物量的變化
            3.3.1 不同重金屬脅迫下,EpTDC大腸桿菌過表達株的生物量
            3.3.2 不同重金屬脅迫下,EpASMT大腸桿菌過表達株的生物量
        3.4 不同重金屬脅迫下,轉(zhuǎn)基因擬南芥生長情況和生物量的測定
            3.4.1 Cd²⁺脅迫下EpTDC擬南芥過表達株生長情況
            3.4.2 Cu²⁺脅迫下EpTDC擬南芥過表達株生長情況
            3.4.3 Zn²⁺脅迫下EpTDC擬南芥過表達株生長情況
            3.4.4 Pb²⁺脅迫下EpTDC擬南芥過表達株生長情況
            3.4.5 Cd²⁺脅迫下EpASMT擬南芥過表達株生長情況
            3.4.6 Cu²⁺脅迫下EpASMT擬南芥過表達株生長情況
            3.4.7 Zn²⁺脅迫下EpASMT擬南芥過表達株生長情況
            3.4.8 Pb²⁺脅迫下EpASMT擬南芥過表達株生長情況
        3.5 EpTDC、EpASMT過表達株體內(nèi)Cd²⁺積累的特征
    4 討論
第七章 全文總結(jié)與展望
    1 本文主要結(jié)論
    2 本研究的創(chuàng)新點
    3 展望
附錄
    附錄1 EpTDC堿基序列
    附錄2 EpSNAT堿基序列
    附錄3 EpASMT堿基序列
    附錄4 質(zhì)粒圖譜
        附錄4.1 pET28a原核表達載體圖譜
        附錄4.2 Pcambial304擬南芥表達載體圖譜
    附錄5. 培養(yǎng)基、試劑的配制
參考文獻
攻讀碩士學位期間完成的科研成果
致謝



本文編號：3891188