發(fā)布時(shí)間：2023-04-05 19:01

　　金屬鉛由于其特殊的物理化學(xué)性質(zhì)在工業(yè)上被廣泛使用,隨后沉積在環(huán)境中。但是,對(duì)于生物體來說,鉛并不是機(jī)體所需要的元素,反而會(huì)機(jī)體帶來很大危害,能夠引起神經(jīng)、血液、胃腸道、生殖系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等的毒性。不過,鉛消化毒性機(jī)理研究還不多見。在本課題組首次發(fā)現(xiàn)高濃度鉛抑制斑馬魚(Danio rerio)胰蛋白酶原基因ela2L表達(dá)的基礎(chǔ)上,本研究利用0.1、0.2和0.3g/L的Pb(NO3)2處理斑馬魚胚胎,real-timePCR和胚胎整體原位雜交結(jié)果均顯示,鉛處理均使斑馬魚胰蛋白酶原基因的表達(dá)下調(diào)。鄰聯(lián)茴香胺染色實(shí)驗(yàn)表明0.2g/L Pb(NO3)2使斑馬魚胚胎中血紅素水平降低,RT-PCR和real-time PCR實(shí)驗(yàn)證實(shí)這個(gè)降低具有雙重性,0.2g/LPb(NO3)2一方面使血紅素合成過程中部分酶的基因表達(dá)水平降低,另一方面使控制血紅素降解的ho-1表達(dá)升高,既抑制了血紅素的合成又促進(jìn)其降解。最近,已有研究證實(shí)血紅素對(duì)斑馬魚胰蛋白酶原基因的調(diào)節(jié)是通過Bach1b/Nrf2a-MafK路徑實(shí)現(xiàn)的。由此,我們有理由相信,鉛可使血紅素水平降低,再通過血紅素-Bach/Nrf-Maf...

【文章頁數(shù)】：77 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
1 前言
    1.1 重金屬鉛對(duì)生物體的影響
    1.2 鉛對(duì)血紅素的影響
    1.3 血紅素的生物合成和降解
        1.3.1 血紅素合成
        1.3.2 血紅素降解
    1.4 血紅素的生理學(xué)功能
    1.5 血紅素調(diào)控路徑
        1.5.1 CNC家族
        1.5.2 血紅素-Bach/Nrf-Maf路徑
        1.5.3 Bach/Nrf-Maf路徑組分簡(jiǎn)介
        1.5.4 全基因組倍增
    1.6 血紅素、Bach/Nrf-Maf路徑和胰蛋白酶原基因
    1.7 模式生物斑馬魚
    1.8 本研究的目的及意義
2 實(shí)驗(yàn)材料與方法
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 斑馬魚的來源和飼養(yǎng)
        2.1.2 ZF4細(xì)胞的來源和培養(yǎng)
    2.2 工具酶、載體和試劑盒
    2.3 主要的生化試劑
    2.4 主要實(shí)驗(yàn)藥品的配制
    2.5 引物列表
    2.6 主要儀器設(shè)備
    2.7 實(shí)驗(yàn)方法
        2.7.1 實(shí)驗(yàn)材料的獲得
        2.7.2 斑馬魚總RNA與ZF4細(xì)胞RNA樣品的獲取
        2.7.3 目的基因擴(kuò)增
        2.7.4 目的DNA片段回收
        2.7.5 目的DNA片段連接到載體上
        2.7.6 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞以及陽性檢測(cè)
        2.7.7 斑馬魚胚胎整體原位雜交
        2.7.8 σ-dianisidine(鄰聯(lián)茴香胺)染色
        2.7.9 RT-PCR
        2.7.10 Real-time RCR
        2.7.11 MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率
3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果和分析
    3.1 斑馬魚bach基因的克隆與同源性分析
        3.1.1 斑馬魚bach基因的克隆
        3.1.2 斑馬魚Bach蛋白同源性分析
        3.1.3 斑馬魚Bach蛋白系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析
    3.2 斑馬魚bach基因時(shí)空表達(dá)研究
        3.2.1 RT-PCR研究斑馬魚bach基因發(fā)育各時(shí)期的表達(dá)情況
        3.2.2 胚胎整體原位雜交技術(shù)研究斑馬魚bach基因的時(shí)空表達(dá)情況
    3.3 bach基因?qū)︺U毒性的應(yīng)答差異
    3.4 斑馬魚nrf1a和nrf2b基因的時(shí)空表達(dá)情況
        3.4.1 探針的合成
        3.4.2 胚胎整體原位雜交
    3.5 鉛抑制胰蛋白酶原基因表達(dá)的分子路徑
        3.5.1 胚胎整體原位雜交檢測(cè)不同濃度鉛處理對(duì)胰蛋白酶原基因表達(dá)的影響
        3.5.2 Real-time PCR檢測(cè)不同濃度鉛處理對(duì)胰蛋白酶原基因表達(dá)的影響
    3.6 鉛對(duì)血紅素生物合成與降解的影響
        3.6.1 血紅素染色實(shí)驗(yàn)
        3.6.2 鉛處理對(duì)血紅素合成酶基因的影響
        3.6.3 鉛處理對(duì)血紅素降解相關(guān)基因的影響
    3.7 血紅素調(diào)節(jié)胰蛋白酶原基因表達(dá)的分子路徑初探
    3.8 鉛是否通過Bach/Nrf調(diào)控途徑抑制胰蛋白酶原基因的表達(dá)
        3.8.1 鉛處理斑馬魚胚胎對(duì)Bach/Nrf-Maf調(diào)控途徑相關(guān)基因的影響
        3.8.2 羥基酪醇對(duì)斑馬魚ZF4細(xì)胞胰蛋白酶原基因的影響
4 討論與展望
    4.1 斑馬魚bach基因的克隆、序列比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育樹分析
    4.2 bach基因表達(dá)模式研究
    4.3 鉛抑制胰蛋白酶原基因表達(dá)的分子路徑
        4.3.1 鉛通過調(diào)控血紅素生物合成酶的轉(zhuǎn)錄來抑制血紅素合成
        4.3.2 血紅素調(diào)節(jié)的Bach/Nrf-Maf路徑調(diào)節(jié)胰蛋白酶原基因表達(dá)
        4.3.3 鉛直接通過Bach/Nrf-Maf路徑調(diào)節(jié)胰蛋白酶原基因表達(dá)
    4.4 展望
參考文獻(xiàn)
研究生期間學(xué)術(shù)論文已發(fā)表及待發(fā)表情況
致謝



本文編號(hào)：3783953