發(fā)布時(shí)間：2021-07-30 06:47

　　本論文中首次使用假單胞菌屬中的銅綠假單胞菌作為載體,通過分子生物學(xué)手段在其表面展示表達(dá)一種對(duì)鎘離子具有特異性響應(yīng)吸附能力的重金屬結(jié)合蛋白CadR。CadR蛋白的表達(dá)賦予了銅綠假單胞菌卓越的鎘離子吸附能力,這種吸附能力是對(duì)鎘離子特異性的,工程菌對(duì)其他重金屬離子無吸附能力,與此同時(shí)低濃度的其他離子不會(huì)干擾工程菌對(duì)鎘離子的專一性吸附。由于工程菌采用由帶有微型Tn5轉(zhuǎn)座子的自殺型質(zhì)粒pBAM1將目的基因插入銅綠假單胞菌染色體基因組中表達(dá)的方式,染色體表達(dá)賦予了工程銅綠假單胞菌優(yōu)秀的遺傳穩(wěn)定性,這種穩(wěn)定性對(duì)于工程菌的后續(xù)應(yīng)用至關(guān)重要。為了得到工程銅綠假單胞菌最佳的環(huán)境吸附條件也考察了溫度和酸堿度對(duì)工程菌鎘離子吸附能力的影響,發(fā)現(xiàn)工程菌在30℃,pH=7時(shí),鎘離子吸附能力達(dá)到最佳狀態(tài)。本研究中,我們進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)室規(guī)模下的工程銅綠假單胞菌應(yīng)用于水體和土壤鎘污染的修復(fù)實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明,工程菌在水體中吸附效果優(yōu)異,在1000μM的鎘離子LB培養(yǎng)液中,振蕩培養(yǎng)12小時(shí)候,對(duì)鎘離子的吸附能力達(dá)到132μmol/g細(xì)胞濕重,并且這種吸附能力是特異性的,而且低濃度的其他二價(jià)陽(yáng)離子不會(huì)影響其對(duì)鎘離子的吸附能力。工... 

【文章來源】：湖南大學(xué)湖南省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁(yè)數(shù)】：55 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

重疊PCR的引物及其產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖

圖 2.2pET28a 質(zhì)粒的質(zhì)粒圖譜使用 XbaI 限制性內(nèi)切酶單酶切純化之后，再使用 BamHI 對(duì)酶切后 分子進(jìn)行單酶切，依然使用 20μL 酶切體系，具體配比為：1μL BamH切酶，2μL SmartCut Buffer，15μL 基因片段或質(zhì)粒，2μL ddH2O。于 切過夜，酶切之后使用天根公司生產(chǎn)的普通 DNA 產(chǎn)物純化試劑盒進(jìn)行后的產(chǎn)物經(jīng)過純化后通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行初步鑒定。得到的質(zhì)粒載體的線性 DNA 分子和目的基因 INP-cadR 基因片段含有位點(diǎn)，我們使用 T4 DNA 連接酶對(duì)其進(jìn)行連接，20μL 連接體系如下：cadR 基因片段，0.5μL pET28a 質(zhì)粒線性分子，2μLT4 連接酶，2μL r。于 PCR 儀中 16℃培養(yǎng)過夜。連接產(chǎn)物使用熱激法轉(zhuǎn)入大腸桿菌 BL21法的操作步驟如下：（1）從-80 ℃超低溫冰箱中取一管凍存的感受態(tài)大腸桿菌 BL21(DE3)化復(fù)蘇 30 分鐘（注意感受態(tài)細(xì)胞不要反復(fù)凍融，否則會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率（2）加入待轉(zhuǎn)化的連接產(chǎn)物 2μL，使用移液槍溫和地吹打混勻，冰盒

用 T7-F 和 T7-R 引物對(duì)，以原始 pET28a 質(zhì)粒和 pET28a-INP-cadR 質(zhì)粒進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增后對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳后得到的的瓊脂糖凝膠電泳圖果與討論-cadR 基因片段插入 pET28a 質(zhì)粒通過 PCR 擴(kuò)增獲得其 T7 啟動(dòng)使用 T7-F 和 T7-R 引物對(duì)對(duì)原始 pET28a 質(zhì)粒和 pET28a-INP-cR 驗(yàn)證，圖 2.3 顯示出，INP-cadR 片段已經(jīng)插入 T7 系統(tǒng)中�？傞L(zhǎng)INP-cadR 基因片段，隨后插入 pBAM1 質(zhì)粒，以期通過 pBAM1 子將目的基因隨機(jī)的插入宿主的染色體 DNA 中，對(duì) pBAMpET-INP-cadR 質(zhì)粒的酶切結(jié)果顯示，目的基因已經(jīng)插入原始質(zhì)�；筮M(jìn)行 DNA 水平電泳，瓊脂糖凝膠電泳圖如圖 2.4 所示。 軟件繪制目標(biāo)質(zhì)粒的基因圖譜，圖譜中包含目標(biāo)質(zhì)粒的基本基粒圖譜如圖 2.5 所示，得到的目的質(zhì)粒以自殺型質(zhì)粒 pBAM1 為7 啟動(dòng)子終止子系統(tǒng)增強(qiáng)表達(dá)的目的基因，T7 系統(tǒng)中含有 6-His

【參考文獻(xiàn)】：
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