本文關(guān)鍵詞：基于PCR-DGGE技術(shù)的原油降解菌群落結(jié)構(gòu)分析，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：傳統(tǒng)篩菌技術(shù)已不能達(dá)到現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)?zāi)康?基于16S rDNA基因特定片段的擴(kuò)增和測序分析,DGGE已成為研究微生物群落結(jié)構(gòu)的重要技術(shù)之一。它已在各種自然生境的微生物群落組成研究中得到運(yùn)用,解決了傳統(tǒng)方法的片面性。本文立足于天津渤海灣溢油污染的生物修復(fù)問題,利用PCR-DGGE技術(shù)對原油降解菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行初步研究。優(yōu)化PCR-DGGE的實(shí)驗(yàn)條件,利用指紋圖譜、條帶測序、系統(tǒng)發(fā)育樹分析對原油降解菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究,為以后的相關(guān)研究提供基礎(chǔ)的方法支持。采集天津渤海灣灘涂沉積物中,以原油為唯一碳源,富集的原油降解菌群用于PCR-DGGE實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)周期為2個月,7d取樣一次,總8個樣品。本研究依據(jù)不同的細(xì)菌DNA提取試劑盒對原油降解菌總DNA的提取效果,確定適用于本實(shí)驗(yàn)的試劑盒。通過對PCR體系中引物量、模板量和PCR程序中退火溫度、循環(huán)數(shù)的優(yōu)化,得到理想的PCR條件。同時也對DGGE實(shí)驗(yàn)條件中凝膠濃度、電泳電壓與時間進(jìn)行了優(yōu)化,確定了DGGE條件。本研究結(jié)論如下:(1)在選用的細(xì)菌DNA提取試劑盒中,New Probe試劑盒提取樣品的總DNA質(zhì)量與純度最優(yōu)且滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求,本研究選用New Probe試劑盒。(2)優(yōu)化后的PCR條件為:擴(kuò)增體系包括25μL Master、3μL DNA模板、1μL Primer-1、1μL Primer-2、20μLddH2O。擴(kuò)增程序即:94℃預(yù)變性4min;94℃變性1min、55℃退火1min、72℃延伸1min,25個循環(huán)、72℃延伸6min。優(yōu)化后的DGGE條件為凝膠濃度為8%、變性范圍為30%-60%、電泳溫度為60℃、電壓和時間為60v,16h。(3)在實(shí)驗(yàn)周期內(nèi),根據(jù)原油降解菌的DGGE指紋圖譜來分析,不同菌進(jìn)入新環(huán)境之后適應(yīng)時間存在一定差異,但是整體上原油降解菌群的群落結(jié)構(gòu)相對比較穩(wěn)定,沒有出現(xiàn)明顯的減弱趨勢。(4)由測序結(jié)果可知,在群落結(jié)構(gòu)中α變形菌較多。其中玫瑰桿菌屬(Roseobacter.sp.)、節(jié)桿菌屬(Arthrobacter.sp.)、假單胞菌屬(Pseudomonas sp.)、微球菌屬(Microbacterium sp.)均是常見的原油降解菌屬。
【關(guān)鍵詞】：DNA提取 PCR-DGGE 石油烴降解菌 群落結(jié)構(gòu)
【學(xué)位授予單位】：天津理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：X172;X55
【目錄】：

• 摘要5-6
• Abstract6-9
• 第一章 緒論9-21
• 1.1 微生物修復(fù)海洋原油污染9-10
• 1.1.1 微生物修復(fù)海洋原油污染的優(yōu)勢9
• 1.1.2 微生物修復(fù)海洋原油污染的研究進(jìn)展9-10
• 1.2 海洋環(huán)境微生物多樣性研究的方法10-11
• 1.2.1 傳統(tǒng)平板培養(yǎng)方法10
• 1.2.2 磷脂脂肪酸譜圖分析法10-11
• 1.2.3 分子生物學(xué)方法11
• 1.3 PCR-DGGE指紋圖譜技術(shù)11-18
• 1.3.1 16SrDNA序列分析技術(shù)的優(yōu)勢性11-12
• 1.3.2 核酸的提取12-13
• 1.3.3 PCR技術(shù)13-14
• 1.3.4 DGGE技術(shù)14-17
• 1.3.5 PCR-DGGE技術(shù)在環(huán)境科學(xué)中微生物方面的應(yīng)用17-18
• 1.4 研究目的、內(nèi)容和技術(shù)路線圖18-21
• 1.4.1 研究目的18
• 1.4.2 研究內(nèi)容18-19
• 1.4.3 研究路線圖19-21
• 第二章 原油降解菌總DNA提取條件的優(yōu)化21-29
• 2.1 引言21
• 2.2 實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備21-22
• 2.3 材料與方法22-24
• 2.3.1 實(shí)驗(yàn)材料22
• 2.3.2 原油降解菌的馴化方法22-23
• 2.3.3 原油降解菌總DNA的提取方法23-24
• 2.4 結(jié)果與討論24-28
• 2.4.1 含油樣品的處理24
• 2.4.2 原油降解菌基因組提取試劑盒的確定24-27
• 2.4.3 原油降解菌群總DNA提取效果27-28
• 2.5 本章小結(jié)28-29
• 第三章 PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化29-37
• 3.1 前言29
• 3.2 材料29-30
• 3.2.1 實(shí)驗(yàn)試劑29-30
• 3.2.2 主要儀器30
• 3.3 PCR實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化30-32
• 3.3.1 PCR擴(kuò)增體系優(yōu)化30-31
• 3.3.2 PCR擴(kuò)增程序優(yōu)化31
• 3.3.3 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測31-32
• 3.4 結(jié)果與討論32-36
• 3.4.1 兩種不同PCR管的擴(kuò)增效果對比32
• 3.4.2 擴(kuò)增體系的優(yōu)化32-34
• 3.4.3 擴(kuò)增程序的優(yōu)化34-36
• 3.4.4 原油降解菌的PCR擴(kuò)增效果36
• 3.5 本章總結(jié)36-37
• 第四章 原油降解菌群結(jié)構(gòu)的DGGE分析37-52
• 4.1 前言37
• 4.2 材料37-38
• 4.2.1 實(shí)驗(yàn)試劑37-38
• 4.2.2 主要儀器38
• 4.3 DGGE技術(shù)38-41
• 4.3.1 制備凝膠溶液38-39
• 4.3.2 凝膠的制備39-40
• 4.3.3 電泳40
• 4.3.4 染色與成像觀察40-41
• 4.4 DGGE實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化41
• 4.4.1 凝膠濃度優(yōu)化41
• 4.4.2 電泳電壓和時間優(yōu)化41
• 4.5 DGGE指紋圖譜與序列分析41-42
• 4.5.1 DGGE指紋圖譜分析41-42
• 4.5.2 DGGE條帶序列分析42
• 4.6 結(jié)果與討論42-51
• 4.6.1 DGGE實(shí)驗(yàn)操作優(yōu)化42-43
• 4.6.2 凝膠濃度優(yōu)化結(jié)果43-44
• 4.6.3 電泳電壓和時間優(yōu)化結(jié)果44
• 4.6.4 原油降解菌的DGGE指紋圖譜與序列分析44-51
• 4.7 本章總結(jié)51-52
• 第五章 結(jié)論與展望52-53
• 5.1 結(jié)論52
• 5.2 展望52-53
• 參考文獻(xiàn)53-60
• 發(fā)表論文及科研情況60-61
• 致謝61-62

【相似文獻(xiàn)】

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1 高淑靜;吳鳳芝;;PCR-DGGE技術(shù)在土壤微生物多樣性研究中的應(yīng)用[J];生物信息學(xué);2007年04期

2 劉園園;姜偉偉;秦紅玉;張卉;王士長;;PCR-DGGE技術(shù)在水牛瘤胃產(chǎn)甲烷菌多樣性分析中的應(yīng)用[J];南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào);2011年09期

3 胡日新;潘立博;姜新;王靖宇;王福金;;負(fù)壓處理梯度電泳凝膠對PCR-DGGE實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響[J];實(shí)驗(yàn)動物科學(xué);2014年03期

4 于潔;馮p

本文編號：330345