硅結合蛋白Si-tag在解脂耶氏酵母細胞表面的展示研究
發(fā)布時間：2021-06-28 19:12
二氧化硅（SiO2）作為硅酸鹽的主要成分,廣泛應用于基礎設施建設、房地產(chǎn)等領域。隨著中國現(xiàn)代化建設進程加劇,對于二氧化硅的需求越來越大,但由于大量的開采和不合理利用,導致二氧化硅資源短缺并帶來了嚴重的環(huán)境污染問題,并且情況不斷惡化。針對二氧化硅傳統(tǒng)采集方法和使用的局限性,急需一種高效環(huán)保的富集二氧化硅的方法。本研究希望通過微生物學方法構建一種表面展示硅結合蛋白Si-tag的酵母工程菌,以期建立一種節(jié)能環(huán)保且能富集SiO2的方法。主要研究工作如下:（1）研究了Si-tag結合SiO2的生物學功能及結合最適條件。將Si-tag與增強型綠色熒光蛋白EGFP融合,并成功在大腸桿菌BL21（DE）中表達。將純化的融合蛋白與SiO2顆粒共同孵育后洗滌,于熒光顯微鏡下觀察到SiO2顆粒表面有綠色熒光,驗證了Si-tag與SiO2顆粒吸附的功能;同時Si-tag吸附SiO2玻璃片的最適時間為50min,最適溫度為30°C,最適pH為8.0。（2）成功...
【文章來源】：華中科技大學湖北省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校
【文章頁數(shù)】：76 頁
【學位級別】：碩士
【部分圖文】：
Si-tag在硅材料表面形成不可逆的吸附原理簡圖
圖 2.1 A：pET28a 質粒圖譜；B：EGFP 的電泳檢測。M：DNA marker Ds 5000；1：EGF基因；C：pET28aE 的雙酶切電泳檢測。M：DNA marker Ds 5000；1：經(jīng) EcoR I 和 Sal I 雙切的 pET28aE 電泳檢測Fig.2.1 A: pET28a expression vector; B: Gel electrophoresis of EGFP. M: DNA marker Ds 500lane 1: Gel electrophoresis of EGFP gene. C: Gel electrophoresis of double digested recombinantplasmids pET28aE. M: DNA marker Ds 5000; Lane 1: Double digested recombinant plasmidspET28aE with EcoR I and Sal I.2.2.2 表達載體 pET28aSE 的構建以 pUC57F 為模板，SE-F1：CGCGAATTCATGCACCACCACCACCACCACGC（劃線部分為 EcoR I 酶切位點）和 SE-R1：AGCTCCTCGCCCTTAGAAACCTTGATCGTCGTCGCACGA 為上下游引物擴增硅結合蛋白 Si-tag，純化回收獲得目片段 a；以 pUC57C 為模板，SE-F2：TCGTGCGACGACGATCCAAGGTTTCTAAGGCGAGGAGCT 和 SE-R2：CGCGTCGACTTACTTGTAGAGCTCGTCCATACC（線部分為 Sal I 酶切位點）為上下游引物擴增 EGFP，純化回收獲得目的片段 b；目的片段 a 和目的片段 b 為模板，SE-F1 和 SE-R2 為上下游引物擴增得融合基因 SE
2.2 A：PCR 產(chǎn)物電泳檢測。M：DNA Marker (Ds 5000)；1：基因 a 的電泳檢電泳檢測；3：基因 SE 的電泳檢測；B：重組質粒 pET28aSE 雙酶切電泳檢測er (Ds 5000)；1：重組質粒 pET28aSE 的電泳檢測；2：經(jīng) EcoR I 和 Sal I 雙酶切的電泳檢測Fig.2.2 A: Gel electrophoresis of PCR productions. M: DNA Marker (Ds 5000); lanetrophoresis of gene a; lane 2: Gel electrophoresis of gene b; lane 3: Gel electrophoresSE; B:Gel electrophoresis of double digested recombinant plasmids pET28aSE. M: D 5000); lane 1: Gel electrophoresis of recombinant plasmids pET28aSE; lane 2: Doubrecombinant plasmids pET28aSE with EcoR I and Sal I. BL21(DE)重組菌株的陽性驗證提取重組質粒 pET28aE 和 pET28aSE，在蛋白表達宿主 BL21(DE)中轉后挑取單克隆進行陽性驗證，結果如圖 2.3。PCR 獲得的特異性條帶與相符，說明重組質粒均已成功導入到了表達宿主 BL21(DE)中，并通過了目的基因準確轉入到 BL21(DE)中并無突變。
【參考文獻】：
期刊論文
[1]細菌表面展示技術研究新進展[J]. 向紅英,王菊芳,楊愈豐,呂延成. 生物化學與生物物理進展. 2019(02)
[2]煤化工工藝中二氧化碳減排技術研究[J]. 王衛(wèi)峰. 化工設計通訊. 2018(12)
[3]硅酸鹽細菌對電解錳渣中有效硅的活化研究[J]. 陳振興,李佳,杜冬云,葉恒朋,藍際榮,呂瑩. 硅酸鹽通報. 2018(11)
[4]利用GAP啟動子在畢赤酵母中組成型表達人鵝型溶菌酶2[J]. 黃鵬,閻麗萍,張寧,石金磊. 中國生物工程雜志. 2018(10)
[5]全細胞生物傳感器的設計及其在環(huán)境監(jiān)測中的應用[J]. 秦偉彤,田健,伍寧豐. 生物技術進展. 2018(05)
[6]煤粉燃燒器氮氧化污染物減排方法研究[J]. 譚靜. 環(huán)境科學與管理. 2018(06)
[7]革蘭氏陰性菌脂多糖運輸系統(tǒng)的構成及作用機制[J]. 莫婷,劉馬峰,程安春. 微生物學報. 2018(09)
[8]大腸桿菌表達系統(tǒng)和酵母表達系統(tǒng)的研究進展[J]. 祁浩,劉新利. 安徽農業(yè)科學. 2016(17)
[9]凝血因子X和蛋白酶Factor Xa的機理研究概況[J]. 黃晶. 海峽藥學. 2016(07)
[10]連接肽在融合蛋白設計中的選擇及應用[J]. 于健,Sarra Setrerrahmane,徐寒梅. 藥物生物技術. 2016(03)
博士論文
[1]畢赤酵母AOX1啟動子轉錄調控機制研究[D]. 王小龍.華東理工大學 2016
[2]利用冰晶核蛋白構建細菌細胞表面展示體系及其應用研究[D]. 李茜茜.華中農業(yè)大學 2009
碩士論文
[1]黑曲霉細胞表面展示CALB的催化特性及其應用[D]. 李遠鋒.華南理工大學 2018
本文編號：3254891
【文章來源】：華中科技大學湖北省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校
【文章頁數(shù)】：76 頁
【學位級別】：碩士
【部分圖文】：
Si-tag在硅材料表面形成不可逆的吸附原理簡圖
圖 2.1 A：pET28a 質粒圖譜；B：EGFP 的電泳檢測。M：DNA marker Ds 5000；1：EGF基因；C：pET28aE 的雙酶切電泳檢測。M：DNA marker Ds 5000；1：經(jīng) EcoR I 和 Sal I 雙切的 pET28aE 電泳檢測Fig.2.1 A: pET28a expression vector; B: Gel electrophoresis of EGFP. M: DNA marker Ds 500lane 1: Gel electrophoresis of EGFP gene. C: Gel electrophoresis of double digested recombinantplasmids pET28aE. M: DNA marker Ds 5000; Lane 1: Double digested recombinant plasmidspET28aE with EcoR I and Sal I.2.2.2 表達載體 pET28aSE 的構建以 pUC57F 為模板，SE-F1：CGCGAATTCATGCACCACCACCACCACCACGC（劃線部分為 EcoR I 酶切位點）和 SE-R1：AGCTCCTCGCCCTTAGAAACCTTGATCGTCGTCGCACGA 為上下游引物擴增硅結合蛋白 Si-tag，純化回收獲得目片段 a；以 pUC57C 為模板，SE-F2：TCGTGCGACGACGATCCAAGGTTTCTAAGGCGAGGAGCT 和 SE-R2：CGCGTCGACTTACTTGTAGAGCTCGTCCATACC（線部分為 Sal I 酶切位點）為上下游引物擴增 EGFP，純化回收獲得目的片段 b；目的片段 a 和目的片段 b 為模板，SE-F1 和 SE-R2 為上下游引物擴增得融合基因 SE
2.2 A：PCR 產(chǎn)物電泳檢測。M：DNA Marker (Ds 5000)；1：基因 a 的電泳檢電泳檢測；3：基因 SE 的電泳檢測；B：重組質粒 pET28aSE 雙酶切電泳檢測er (Ds 5000)；1：重組質粒 pET28aSE 的電泳檢測；2：經(jīng) EcoR I 和 Sal I 雙酶切的電泳檢測Fig.2.2 A: Gel electrophoresis of PCR productions. M: DNA Marker (Ds 5000); lanetrophoresis of gene a; lane 2: Gel electrophoresis of gene b; lane 3: Gel electrophoresSE; B:Gel electrophoresis of double digested recombinant plasmids pET28aSE. M: D 5000); lane 1: Gel electrophoresis of recombinant plasmids pET28aSE; lane 2: Doubrecombinant plasmids pET28aSE with EcoR I and Sal I. BL21(DE)重組菌株的陽性驗證提取重組質粒 pET28aE 和 pET28aSE，在蛋白表達宿主 BL21(DE)中轉后挑取單克隆進行陽性驗證，結果如圖 2.3。PCR 獲得的特異性條帶與相符，說明重組質粒均已成功導入到了表達宿主 BL21(DE)中，并通過了目的基因準確轉入到 BL21(DE)中并無突變。
【參考文獻】：
期刊論文
[1]細菌表面展示技術研究新進展[J]. 向紅英,王菊芳,楊愈豐,呂延成. 生物化學與生物物理進展. 2019(02)
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[3]硅酸鹽細菌對電解錳渣中有效硅的活化研究[J]. 陳振興,李佳,杜冬云,葉恒朋,藍際榮,呂瑩. 硅酸鹽通報. 2018(11)
[4]利用GAP啟動子在畢赤酵母中組成型表達人鵝型溶菌酶2[J]. 黃鵬,閻麗萍,張寧,石金磊. 中國生物工程雜志. 2018(10)
[5]全細胞生物傳感器的設計及其在環(huán)境監(jiān)測中的應用[J]. 秦偉彤,田健,伍寧豐. 生物技術進展. 2018(05)
[6]煤粉燃燒器氮氧化污染物減排方法研究[J]. 譚靜. 環(huán)境科學與管理. 2018(06)
[7]革蘭氏陰性菌脂多糖運輸系統(tǒng)的構成及作用機制[J]. 莫婷,劉馬峰,程安春. 微生物學報. 2018(09)
[8]大腸桿菌表達系統(tǒng)和酵母表達系統(tǒng)的研究進展[J]. 祁浩,劉新利. 安徽農業(yè)科學. 2016(17)
[9]凝血因子X和蛋白酶Factor Xa的機理研究概況[J]. 黃晶. 海峽藥學. 2016(07)
[10]連接肽在融合蛋白設計中的選擇及應用[J]. 于健,Sarra Setrerrahmane,徐寒梅. 藥物生物技術. 2016(03)
博士論文
[1]畢赤酵母AOX1啟動子轉錄調控機制研究[D]. 王小龍.華東理工大學 2016
[2]利用冰晶核蛋白構建細菌細胞表面展示體系及其應用研究[D]. 李茜茜.華中農業(yè)大學 2009
碩士論文
[1]黑曲霉細胞表面展示CALB的催化特性及其應用[D]. 李遠鋒.華南理工大學 2018
本文編號：3254891
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