酵母表面展示和噬菌體展示技術(shù)已成為蛋白質(zhì)工程,尤其是抗體工程中廣泛應(yīng)用的強(qiáng)大工具。其中酵母展示技術(shù)可以結(jié)合流式細(xì)胞術(shù),直接分析展示蛋白的表達(dá)、穩(wěn)定性以及與互作蛋白的親和力,從而成為高效的文庫篩選體系。酵母表面展示技術(shù)已被廣泛用于針對各種抗原的單鏈抗體（scFv）篩選及其優(yōu)化。然而,基于酵母表面展示技術(shù)的scFv文庫篩選流程中仍存在一些缺陷,限制了系統(tǒng)篩選效率。本研究主要針對scFv文庫構(gòu)建與篩選中存在的兩個(gè)限制因素,對酵母表面展示體系進(jìn)行優(yōu)化。首先,scFv文庫多樣性片段是通過PCR擴(kuò)增、PCR法隨機(jī)突變獲得,再整合到酵母表面展示載體上,構(gòu)成scFv文庫。然而,這一過程中往往會(huì)不可避免地在部分scFv片段內(nèi)部引入終止密碼子,導(dǎo)致不能表達(dá)完整的單鏈抗體。文庫中這樣的片段占比增加,不僅影響有效庫容量,還影響篩選效率。其次,篩選的scFv亞文庫一般需要進(jìn)行高溫穩(wěn)定性驗(yàn)證,獲得穩(wěn)定性更高的目標(biāo)scFv。而傳統(tǒng)驗(yàn)證體系中存在的問題是,當(dāng)篩選出的scFv庫需要進(jìn)行高溫穩(wěn)定性篩選或驗(yàn)證時(shí),往往由于酵母本身不耐高溫而需要將熱激后的細(xì)胞收集起來提取文庫質(zhì)粒,再重新轉(zhuǎn)入工程酵母中流式分選。這個(gè)過程不僅耗時(shí)... 

【文章來源】：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)河北省

【文章頁數(shù)】：65 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

抗體多肽鏈亞基組成和結(jié)構(gòu)域分布模型

用于蛋白質(zhì)工程的酵母表面展示體系的優(yōu)化和應(yīng)用而且噬菌體展示的庫容量多樣性在 109~1011。然中很好地表達(dá)，在一些情況下，異源蛋白的展示響宿主細(xì)胞生長，甚至清除表達(dá)異源蛋白的細(xì)胞且有些蛋白的表達(dá)需要進(jìn)行翻譯后修飾，但是噬折疊等修飾。，酵母是一種強(qiáng)大的遺傳工程工具，它具有真核飾和蛋白質(zhì)質(zhì)量控制。酵母表面展示系統(tǒng)常用的本研究中利用的是釀酒酵母的交配蛋白 a-凝集素基連接組成）。通過將目的蛋白克隆在含 Aga2表達(dá)，并將載體導(dǎo)入含有 Aga1（與酵母細(xì)胞壁，Aga2 與 Aga1 識(shí)別并通過二硫鍵結(jié)合，從而將其中 Aga1 編碼凝集素的核心亞基（725 個(gè)氨基酸亞基（69 個(gè)氨基酸殘基）[41]。

用于蛋白質(zhì)工程的酵母表面展示體系的優(yōu)化和應(yīng)用間位阻的限制而不易被識(shí)別[43]。酵母表面展示還具有真核生物翻譯后修飾，如二硫異構(gòu)化和糖基化等，可折疊和分泌大而復(fù)雜的糖基化目的蛋白。庫中，每個(gè)酵母細(xì)胞可表達(dá)約 5 萬個(gè)特定目的蛋白。高通量的表面展示融母細(xì)胞的大小使得酵母表面展示平臺(tái)能夠很好地與流式細(xì)胞術(shù)結(jié)合，這樣合文庫進(jìn)行定量篩選和精細(xì)區(qū)分不同的目的蛋白（結(jié)合劑）與靶標(biāo)的結(jié)合即精細(xì)的親和力識(shí)別）[44,45]。此外，流式細(xì)胞分選可以在不進(jìn)行目的蛋白蛋白分泌表達(dá)純化的前提下很容易地檢測出酵母展示蛋白與靶標(biāo)相互作用等生物物理特征[46-48]。因此，酵母表面顯示是一種很好的真核蛋白或多硫平臺(tái)。常酵母表面展示技術(shù)篩選文庫中 scFv 及鑒定 scFv 的親和力，會(huì)采用磁力S 篩選的兩種方式[41, 45]。首先，在磁力篩選中，將表達(dá) scFv 文庫的酵母靶標(biāo)（抗原）的微米磁珠共同孵育，隨后用磁鐵對酵母-磁珠混合物進(jìn)行分酵母與磁珠的強(qiáng)烈相互作用下，使得與靶標(biāo)親和力較低的 scFv 片段也能。然后利用流式細(xì)胞術(shù)對磁力篩選后獲得的酵母細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步的篩選，與靶標(biāo)（抗原）具有更高親和力的 scFv 文庫細(xì)胞（圖 3）。


本文編號(hào)：3110787