環(huán)己胺作為一種重要的精細化工中間體,給大氣和水體帶來了嚴重的污染,該化合物還具有一定的致癌性。Pseudomonas plecoglossicida NyZ12是一株能利用環(huán)己胺為唯一碳源、氮源和能源生長的菌株,其環(huán)己胺代謝的分子生物學機理仍未闡述清楚。本實驗室在前期研究假單胞菌NyZ12中環(huán)己胺的降解途徑中,將amo2631克隆到廣宿主表達載體pVLT33,在假單胞菌PaW340中表達和純化,最終成功得到amo2631所表達蛋白,在其轉(zhuǎn)化的過程中,也成功檢測到產(chǎn)物環(huán)己酮的生成,驗證了該基因的功能。然而,采用無痕敲除技術(shù)敲除了amo2631后,突變體仍然能夠以環(huán)己胺為唯一碳氮源良好的生長,僅生長速率受到了一定的影響,表明了該菌株在環(huán)己胺的初始代謝步驟中存在代謝冗余機制,即可能含有兩個或兩個以上的基因共同完成環(huán)己胺到環(huán)己酮的代謝過程。本論文的目的在于探究環(huán)己胺的初始代謝步驟的冗余基因,充分揭示假單胞菌NyZ12代謝環(huán)己胺的分子機理。為了達到該目的,采用了生物信息學分析、基因組建庫篩選和轉(zhuǎn)座子插入突變體庫三種方式篩選環(huán)己胺降解相關(guān)基因,得到了基因 orf671、orf5356、orf566... 

【文章來源】：武漢輕工大學湖北省

【文章頁數(shù)】：75 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖３．．?１－１?Ｋ５／ＸＫ６引物對鑒定單交換ＷＨＡ５５３９??Ｍ：?ＤＮＡ?Ｍａｒｋｅｒ?ＤＬ２０００；?１￣３：?Ｋ５／ＸＫ６?引物對擴增片段??

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２５０??１〇０?丨一?ｌｊ??圖３．．?１－１?Ｋ５／ＸＫ６引物對鑒定單交換ＷＨＡ５５３９??Ｍ：?ＤＮＡ?Ｍａｒｋｅｒ?ＤＬ２０００；?１￣３：?Ｋ５／ＸＫ６?引物對擴增片段??３．１．２雙交換鑒定??將單交換菌株與ＬＢ（含Ａｍｐ）的液體培養(yǎng)進行傳代３次，涂布于ＬＢ（含Ａｍｐ）??的固體培養(yǎng)基上，得到均勻分布的菌落。挑取單菌落進行培養(yǎng)后，以菌液作為模??板，以Ｋ５／ＸＫ６為引物進行ＰＣＲ鑒定，鑒定結(jié)果如圖所示，相比于單交換菌株，??Ｋ５／ＸＫ６僅得到２６０ｂｐ的條帶（圖３．１－２），即為發(fā)生了雙交換的陽性克隆菌株，即??為四敲除突變體ＮｙＺ１２Ａ４。??３０??

【參考文獻】：
期刊論文
[1]Pseudomonas plecoglossicida NyZ12基因無痕敲除方法的建立[J]. 毛靈琪,李存治,閆達中.  生物技術(shù)通報. 2016(04)
[2]水體中基因組提取方法的比較及水體中銅綠假單胞菌檢測技術(shù)的研究[J]. 張淑紅,許文濤,石慧,程國靈,羅云波,黃昆侖.  食品工業(yè)科技. 2012(09)
[3]2,4-二硝基苯肼顯色法測定環(huán)己酮含量[J]. 李凌凌,呂早生,黃樂繁,侯亞利,庹保華,劉郭飛.  化學與生物工程. 2010(05)

碩士論文
[1]環(huán)己胺降解菌NyZ12胺氧化酶基因敲除突變體的構(gòu)建及特性研究[D]. 毛靈琪.武漢輕工大學 2016
[2]假單胞菌NyZ12中環(huán)己胺氧化酶基因的克隆、表達與純化[D]. 李存治.武漢輕工大學 2016



本文編號：2993036