微生物修復(fù)的方法被認(rèn)為是解決石油污染的一種有效綠色又節(jié)能的手段。截至目前,已有多種石油降解菌株、石油降解的途徑及相關(guān)酶系被分離鑒定出來,降解相關(guān)的調(diào)控已有部分推進(jìn)。然而,中長(zhǎng)鏈烷烴降解作為其中的研究難點(diǎn),其調(diào)控機(jī)制依然不明確。本課題組前期分離出了一株可以高效降解長(zhǎng)度為C12-C32的烷烴類物質(zhì)的銅綠假單胞菌株SJTD-1,通過對(duì)其全基因組測(cè)序及注釋,蛋白質(zhì)組學(xué)分析等方式我們篩選出了一些潛在的與烷烴降解代謝相關(guān)的基因P450₁、P450₂、alkB1、alkB2、almA1、almA2、ladA1、ladA2等,且alkB2基因已被證實(shí)參與了SJTD-1中的中長(zhǎng)鏈烷烴降解。通過Pull-Down實(shí)驗(yàn)我們篩選出了若干個(gè)包括預(yù)測(cè)為CrgA在內(nèi)的可能參與到SJTD-1菌株烷烴降解代謝的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。本工作由體外和體內(nèi)兩方面著手,體外通過CrgA蛋白異源表達(dá)、凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)、Footprinting實(shí)驗(yàn)、解離試驗(yàn),體內(nèi)通過敲除實(shí)驗(yàn)、生長(zhǎng)曲線測(cè)定、RT-qPCR、熒光表達(dá)實(shí)驗(yàn),探究了轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子CrgA對(duì)篩選出的幾個(gè)中長(zhǎng)鏈烷烴降解基因尤其是alkB2基因的... 

【文章來源】：上海交通大學(xué)上海市 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：91 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

烷烴的微生物有氧降解途徑[8]

1.2.1.2 烷烴厭氧降解途徑在厭氧條件下，硝酸鹽或硫酸鹽被用作終端電子受體。迄今為止，有兩種已知的n-烷厭氧降解機(jī)制（圖1-2）。一種是富馬酸鹽的加成途徑另一種是羧化途徑。已經(jīng)研究過的厭氧n-烷烴降解微生物是硫酸鹽還原細(xì)菌，菌株CV2803T，菌株Hxd3，菌株P(guān)nd3，以及反硝化細(xì)菌菌株HxN1。對(duì)具有細(xì)菌富集培養(yǎng)的烷烴的厭氧生物降解也被進(jìn)行了研究。Hxd3 是第一個(gè)在飽和碳?xì)浠衔锷厦黠@生長(zhǎng)的厭氧菌[12]。在單氧酶反應(yīng)被普遍認(rèn)為是有氧微生物代謝的初始階段之前，有人提出，在烷烴的有氧生長(zhǎng)過程中，作為一種替代機(jī)制，一種非氧獨(dú)立的終端雙鍵的形成是一種替代機(jī)制[13]。這種機(jī)制也解釋了在烷烴中某些細(xì)菌的厭氧增長(zhǎng)。先前已經(jīng)證明，一些微生物通過脫氫作用，然后在厭氧條件下添加水

因的表達(dá)載體pET28a-crgA，該質(zhì)粒使得菌株具有卡那霉素抗性，并將該質(zhì)�；瘜W(xué)轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)中，在IPTG的誘導(dǎo)下大量表達(dá)。再經(jīng)鎳柱親和層析純化后，獲得重組蛋白CrgA（見表3-1，圖3-1）。crgA含有915對(duì)堿基，CrgA蛋白含有304個(gè)氨基酸，分子量為34.55kDa。表3-1 CrgA重組蛋白單體性質(zhì)Table3-1PropertyofCrgAprotein蛋白名稱 分子量（kDa） 濃度（mg/ml）CrgA 34.55 2圖3-1 重組CrgA蛋白異源表達(dá)純化SDS-PAGE圖M：蛋白 Marker （單位：kDa）; I1：誘導(dǎo)前裂解液； I2:誘導(dǎo)后裂解液； L：破碎上清液； U：過柱流出液； W1：第一管洗滌液； W2：最后一管洗滌液；E：洗脫液Fig3-1SDS-PAGEanalysisofthepurifiedrecombinantCrgAproteinM:Fermentaseproteinmarker(kDa)；I1:Pre-inductioncelllysissolution；I2:After-inductioncelllysis


本文編號(hào)：2973327