微生物修復(fù)的方法被認為是解決石油污染的一種有效綠色又節(jié)能的手段。截至目前,已有多種石油降解菌株、石油降解的途徑及相關(guān)酶系被分離鑒定出來,降解相關(guān)的調(diào)控已有部分推進。然而,中長鏈烷烴降解作為其中的研究難點,其調(diào)控機制依然不明確。本課題組前期分離出了一株可以高效降解長度為C12-C32的烷烴類物質(zhì)的銅綠假單胞菌株SJTD-1,通過對其全基因組測序及注釋,蛋白質(zhì)組學分析等方式我們篩選出了一些潛在的與烷烴降解代謝相關(guān)的基因P450₁、P450₂、alkB1、alkB2、almA1、almA2、ladA1、ladA2等,且alkB2基因已被證實參與了SJTD-1中的中長鏈烷烴降解。通過Pull-Down實驗我們篩選出了若干個包括預(yù)測為CrgA在內(nèi)的可能參與到SJTD-1菌株烷烴降解代謝的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。本工作由體外和體內(nèi)兩方面著手,體外通過CrgA蛋白異源表達、凝膠阻滯實驗、Footprinting實驗、解離試驗,體內(nèi)通過敲除實驗、生長曲線測定、RT-qPCR、熒光表達實驗,探究了轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子CrgA對篩選出的幾個中長鏈烷烴降解基因尤其是alkB2基因的... 

【文章來源】：上海交通大學上海市 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

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【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

烷烴的微生物有氧降解途徑[8]

1.2.1.2 烷烴厭氧降解途徑在厭氧條件下，硝酸鹽或硫酸鹽被用作終端電子受體。迄今為止，有兩種已知的n-烷厭氧降解機制（圖1-2）。一種是富馬酸鹽的加成途徑另一種是羧化途徑。已經(jīng)研究過的厭氧n-烷烴降解微生物是硫酸鹽還原細菌，菌株CV2803T，菌株Hxd3，菌株P(guān)nd3，以及反硝化細菌菌株HxN1。對具有細菌富集培養(yǎng)的烷烴的厭氧生物降解也被進行了研究。Hxd3 是第一個在飽和碳氫化合物上明顯生長的厭氧菌[12]。在單氧酶反應(yīng)被普遍認為是有氧微生物代謝的初始階段之前，有人提出，在烷烴的有氧生長過程中，作為一種替代機制，一種非氧獨立的終端雙鍵的形成是一種替代機制[13]。這種機制也解釋了在烷烴中某些細菌的厭氧增長。先前已經(jīng)證明，一些微生物通過脫氫作用，然后在厭氧條件下添加水

因的表達載體pET28a-crgA，該質(zhì)粒使得菌株具有卡那霉素抗性，并將該質(zhì)粒化學轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)中，在IPTG的誘導(dǎo)下大量表達。再經(jīng)鎳柱親和層析純化后，獲得重組蛋白CrgA（見表3-1，圖3-1）。crgA含有915對堿基，CrgA蛋白含有304個氨基酸，分子量為34.55kDa。表3-1 CrgA重組蛋白單體性質(zhì)Table3-1PropertyofCrgAprotein蛋白名稱 分子量（kDa） 濃度（mg/ml）CrgA 34.55 2圖3-1 重組CrgA蛋白異源表達純化SDS-PAGE圖M：蛋白 Marker （單位：kDa）; I1：誘導(dǎo)前裂解液； I2:誘導(dǎo)后裂解液； L：破碎上清液； U：過柱流出液； W1：第一管洗滌液； W2：最后一管洗滌液；E：洗脫液Fig3-1SDS-PAGEanalysisofthepurifiedrecombinantCrgAproteinM:Fermentaseproteinmarker(kDa)；I1:Pre-inductioncelllysissolution；I2:After-inductioncelllysis


本文編號：2973327