紅球菌R04(Rhodococcus sp.R04)能夠有效降解多種芳香族化合物,特別是對(duì)生物體有潛在危害的聯(lián)苯(BP)及多氯聯(lián)苯(PCB),其降解過(guò)程對(duì)環(huán)境破壞小,經(jīng)濟(jì)有效且不會(huì)造成二次污染,被認(rèn)為是一種很有前景的芳香族化合物降解方法。目前國(guó)內(nèi)對(duì)于紅球菌的研究主要集中于其代謝芳香族化合物的途徑以及代謝途徑中的多種酶,很少有人研究這些芳香族化合物對(duì)紅球菌產(chǎn)生了怎樣的影響。我們課題組對(duì)紅球菌R04降解聯(lián)苯/多氯聯(lián)苯已經(jīng)研究多年,研究發(fā)現(xiàn),在紅球菌R04降解聯(lián)苯過(guò)程中,紅球菌R04細(xì)胞的分裂和形態(tài)發(fā)生了巨大的變化。但是,在聯(lián)苯降解過(guò)程中,具體是哪種代謝物對(duì)紅球菌R04細(xì)胞的分裂和形態(tài)造成了影響,還未見(jiàn)報(bào)道。在本文中,我們分別用聯(lián)苯(BP)及其代謝物2,3-二羥基聯(lián)苯(DHBP)和2-羥基-6-酮基-6-苯基-2,4-己二烯酸(HOPDA)為碳源培養(yǎng)野生型紅球菌R04細(xì)胞、相應(yīng)代謝酶缺陷型紅球菌R04細(xì)胞以及大腸桿菌BL21細(xì)胞,然后通過(guò)熒光顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)和分裂情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與聯(lián)苯及其它代謝物培養(yǎng)相比,DHBP培養(yǎng)紅球菌R04野生型和相應(yīng)缺陷型細(xì)胞時(shí),細(xì)胞邊界模糊,看不到清晰完整的細(xì)胞分裂隔膜,只觀察到細(xì)胞質(zhì)中的熒光斑點(diǎn);DHBP培養(yǎng)大腸桿菌BL21細(xì)胞時(shí),雖然細(xì)胞膜著色明顯,能看到清晰并完整的細(xì)胞分裂隔膜,但細(xì)胞明顯變小�？梢�(jiàn)2,3-二羥基聯(lián)苯(DHBP)是主要影響紅球菌R04細(xì)胞形態(tài)和分裂的物質(zhì)。此外,為了進(jìn)一步理解聯(lián)苯及其代謝物對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響,本研究選擇了細(xì)胞骨架蛋白之一的MreB進(jìn)行研究。原核細(xì)胞骨架蛋白MreB與真核細(xì)胞肌動(dòng)蛋白同源,MreB蛋白在細(xì)胞膜下方裝配形成螺旋狀結(jié)構(gòu),能在細(xì)胞分裂過(guò)程當(dāng)中指導(dǎo)新生肽聚糖的合成,從而使細(xì)胞保持特定形態(tài)。我們用制備的MreB抗體通過(guò)Western-blot檢測(cè)不同培養(yǎng)條件下不同生長(zhǎng)時(shí)期紅球菌R04細(xì)胞中MreB蛋白的表達(dá)量,結(jié)果顯示無(wú)論是以葡萄糖還是聯(lián)苯為碳源培養(yǎng),從指數(shù)期到轉(zhuǎn)換期再到穩(wěn)定期,紅球菌R04細(xì)胞中MreB蛋白的表達(dá)水平均持續(xù)下調(diào)。另外,與葡萄糖培養(yǎng)條件相比,聯(lián)苯培養(yǎng)條件下檢測(cè)的三個(gè)生長(zhǎng)時(shí)期MreB蛋白的表達(dá)水平均下調(diào)。同時(shí),在熒光顯微鏡下觀察到紅球菌R04從指數(shù)期生長(zhǎng)到穩(wěn)定期,細(xì)胞形態(tài)從桿狀變?yōu)榍驙?且聯(lián)苯對(duì)紅球菌R04細(xì)胞分裂有抑制作用,說(shuō)明MreB蛋白與細(xì)胞桿狀形態(tài)維持以及細(xì)胞分裂有關(guān)。最后,我們構(gòu)建重組表達(dá)載體pGEX-6P-1-mreB,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21細(xì)胞,通過(guò)熒光顯微鏡觀察MreB蛋白過(guò)表達(dá)對(duì)大腸桿菌細(xì)胞形態(tài)的影響,結(jié)果顯示,在大腸桿菌中過(guò)表達(dá)紅球菌R04 MreB蛋白,并不會(huì)使大腸桿菌的細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變。另外,構(gòu)建重組表達(dá)載體pET-m3c-mreB-gfp,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21細(xì)胞,通過(guò)熒光顯微鏡觀察MreB-GFP融合蛋白在大腸桿菌中的定位,結(jié)果顯示MreB-GFP熒光定位于細(xì)胞質(zhì)中,或者熒光在細(xì)胞中部分裂位點(diǎn)及兩極點(diǎn)狀聚集,這可能與其形成包涵體有關(guān)。
【學(xué)位單位】：山西大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：X592;X172
【部分圖文】：

目前人們已經(jīng)研究出了許多消除多氯聯(lián)苯的途徑，包括傳統(tǒng)的封存法、穩(wěn)定掩埋法等物理方法，金屬還原法、氧化氯化法等化學(xué)方法，以及利用好氧微生物、厭氧微生物和植物的天然酶系降解的生物降解法[12]。其中關(guān)于生物降解途徑的研究最為廣泛，因?yàn)樯锝到膺^(guò)程不會(huì)對(duì)環(huán)境造成額外的污染，所以被認(rèn)為是一種很有前景的多氯聯(lián)苯降解途徑。目前為止研究人員已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并分離得到了很多能降解聯(lián)苯/多氯聯(lián)苯等環(huán)境污染物的微生物，Rhodococcus sp. R04（紅球菌 R04）就是其中一種從土壤中分離得到的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌。紅球菌 R04 細(xì)胞內(nèi)有一套聯(lián)苯代謝酶系可以對(duì)聯(lián)苯進(jìn)行代謝，通過(guò)我們課題組之前的研究表明該酶系與世界上公認(rèn)的聯(lián)苯代謝過(guò)程當(dāng)中的酶系相同，該降解過(guò)程主要包括聯(lián)苯雙加氧酶（bphA 基因的產(chǎn)物）、2,3-二氫-2,3-二羥基聯(lián)苯脫氫酶（bphB 基因的產(chǎn)物）、2,3-二羥基聯(lián)苯-1,2-雙加氧酶（bphC 基因的產(chǎn)物）和 2-羥基-6-氧-2,4-已二烯酸水解酶（bphD 基因的產(chǎn)物）[13]。這四種酶降解聯(lián)苯的詳細(xì)過(guò)程如圖 1.1 所示[14]，其中酶 E1 和酶 E3 所催化的反應(yīng)是該降解過(guò)程中的兩個(gè)限速步驟。

1.2.2 細(xì)菌細(xì)胞骨架真核細(xì)胞包括三類重要的細(xì)胞骨架系統(tǒng)：微絲、微管和中間絲，它們分別由肌動(dòng)蛋白、微管蛋白和中間絲蛋白裝配而成[31]。這些系統(tǒng)有助于保持細(xì)胞的形態(tài)完整，它們還參與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、染色體分離、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和胞質(zhì)分裂等生命過(guò)程。長(zhǎng)期以來(lái)，人們普遍認(rèn)為細(xì)菌細(xì)胞中沒(méi)有形成細(xì)胞骨架的元素，直到在細(xì)菌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)所有三種真核細(xì)胞骨架蛋白的同系物，如圖 1.2 所示[31]。越來(lái)越多的證據(jù)表明這些蛋白參與細(xì)菌細(xì)胞的 DNA 分離、細(xì)胞極化、孢子形成等過(guò)程。第一章 文獻(xiàn)綜述

在正確的位置和時(shí)間精確分裂母細(xì)胞。這個(gè)蛋基于一種會(huì)收縮的蛋白質(zhì)環(huán)結(jié)構(gòu)，在細(xì)菌中這真核生物微管蛋白類似物。細(xì)胞分裂過(guò)程[44]中該環(huán)狀結(jié)構(gòu)與細(xì)胞膜的內(nèi)表面相連（圖 1.3 B）合物裝配的支架。Z 環(huán)的形成過(guò)程受到精密的調(diào)位點(diǎn)以及與其它細(xì)胞周期事件相協(xié)調(diào)。接著，Z裂位點(diǎn)形成分裂小體。這些分裂小體的成份大接或間接相互作用被招募到 Z 環(huán)（圖 1.3 C），它將促進(jìn)橫向細(xì)胞壁的合成以及細(xì)胞質(zhì)膜的向內(nèi)生長(zhǎng)最終會(huì)產(chǎn)生一個(gè)完整的隔膜將母細(xì)胞E）。隔膜的形成伴隨著分裂小體的收縮和解聚蛋白必須重新分配、定位到細(xì)胞質(zhì)中和細(xì)胞膜水解酶發(fā)揮作用，使隔膜胞壁質(zhì)分裂從而子細(xì)
【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 皮文清;曲媛媛;張強(qiáng);周集體;;異生型化合物生物降解及調(diào)控機(jī)理研究進(jìn)展[J];環(huán)境科學(xué)與技術(shù);2010年04期

2 胡勁召,陳少瑾,吳雙桃,陳宜菲,謝凝子;多氯聯(lián)苯污染及其處理方法研究進(jìn)展[J];江西化工;2004年04期

3 孫艷,鈔亞鵬,錢世鈞;嗜吡啶紅球菌R04的聯(lián)苯降解途徑的研究[J];微生物學(xué)報(bào);2003年05期

本文編號(hào)：2893323