漆酶是一種含銅的多酚氧化酶,其催化效率高,作用底物范圍廣,在工業(yè)中具有廣闊應(yīng)用前景。本課題利用實驗室獲得的重組解淀粉芽孢桿菌漆酶為基礎(chǔ),通過交聯(lián)酶聚集體(CLEAs)來進行漆酶的固定。對其中影響酶活性的相關(guān)因素進行了優(yōu)化,對游離酶和磁性交聯(lián)漆酶聚集體(magnetic cross-linked enzyme aggregates,M-CLEAs)酶學性質(zhì)進行了分析,對漆酶M-CLEAs在染料降解方面進行應(yīng)用,結(jié)果如下:優(yōu)化后的固定條件為:以飽和硫酸銨為沉淀劑,硫酸銨和漆酶體積比為3:1,沉淀溫度25℃,沉淀3 h后,使用0.16%戊二醛,交聯(lián)1 h,加入的磁性納米粒子與漆酶最優(yōu)質(zhì)量比為7:1,在此制備條件下,最終酶活回收率為37%。與游離酶相比,漆酶M-CLEAs適應(yīng)的pH值范圍更廣,在pH值8.6下相對酶活仍保留50%,而游離酶相對酶活只有25%;在不同體積分數(shù)的有機溶劑下,漆酶M-CLEAs的穩(wěn)定性更好,30%濃度甲醇下漆酶M-CLEAs的酶活是游離酶的1.5倍,在添加較高濃度30%乙醇、丙酮條件下,漆酶M-CLEAs的酶活也均優(yōu)于游離漆酶;在添加不同濃度NaCl后,漆酶M-CLEAs表現(xiàn)出更好地耐鹽性,在高濃度1 M NaCl下,漆酶M-CLEAs保留70%的酶活,而游離漆酶只保留20%酶活。漆酶M-CLEAs在無介體存在時對不同結(jié)構(gòu)的染料脫色效果較差,介體乙酰丁香酮的添加促進了酶與染料的氧化反應(yīng),6 h內(nèi)對靛紅可以完全脫色,活性黑5的脫色率達到90%以上,對RB亮藍也有64%的脫色率;隨著活性黑5和靛紅染料濃度分別提高到160 mg/L和100 mg/L,在6 h后也同樣完全脫色;在重復(fù)降解靛紅實驗中,反復(fù)使用七次,仍有接近30%脫色率,為固定化漆酶應(yīng)用于染料廢水的處理奠定了基礎(chǔ)。
【學位單位】：東北林業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：X703;Q814.9
【部分圖文】：

通過添加交聯(lián)劑使酶分子之間發(fā)生交聯(lián)進行固定。無載體固定大概分為四種類??型：由溶解酶直接交聯(lián)產(chǎn)生（ＣＬＥ）、結(jié)晶酶（ＣＬＥＣ）、噴霧干燥酶（ＣＬＳＤ）和聚合酶??（ＣＬＥＡ）。制備流程如圖１－１所示：??Ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ?ｅｎｚｙｍｅ??？?Ｃｒｏｓｓ－ｌｉｎｋｅｒ??＿?＿??？＾／ＡＧＧ?＾＼＾ＳＤＥ?＼??＃?＃?＃?＾??ＣＬＥＣ?ＣＬＥＡ?ＣＳＤＥ?ＣＬＥ??圖１－１無載體固定化酶制備流程圖??（ａ）結(jié)晶；（ｂ）聚集；（ｃ）噴霧干燥；（ｄ）直接交聯(lián)【１１］??Ｆｉｇ．?１－１?Ｐｒｏｃｅｓｓ?ｏｆ?ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ?ｅｎｚｙｍｅ?ｗｉｔｈｏｕｔ?ｃａｒｒｉｅｒ??（ａ）?ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ；?（ｂ）?ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ；?（ｃ）?ｓｐｒａｙ－ｄｒｙｉｎｇ；?（ｄ）?ｄｉｒｅｃｔ?ｃｒｏｓｓ－ｌｉｎｋｉｎｇ??交聯(lián)溶解酶（ＣＬＥｓ）：在２０世紀６０年代，研究人員發(fā)現(xiàn)使用雙功能交聯(lián)試劑，如戊??二醛，可以將化學基團連接起來，獲得不溶性蛋白的，使其不再溶解，保留了酶的活??性，這種方法即為交聯(lián)溶解酶（ＣＬＥｓ）［１２，１３］。雖然ＣＬＥｓ可以提高酶的熱穩(wěn)定性，但是其??重復(fù)穩(wěn)定性較差

２．３．１．２沉淀劑與漆酶比例對酶活的的影響??通過對沉淀劑與漆酶體積比例的優(yōu)化，考察了?１：１、３：１、５：１、７：１條件下的結(jié)果，??如圖２－２所示。選擇硫酸銨為沉淀劑，２５°Ｃ下，在沉淀劑與漆酶體積比為３：１時，酶活??回收率最高，為７４．５％，由于沉淀劑體積的增加，增大了蛋白分子的沉淀量，酶活回收??率增加。但隨著沉淀劑體積的增加，酶活回收率逐漸下降，這可能是由于過量的沉淀劑??剝奪了酶蛋白分子內(nèi)部的水分，導致酶活回收率降低，在沉淀劑與漆酶比例為７：１時，??酶活回收率下降至５６％�？梢�，沉淀劑的體積多少也會引發(fā)酶不同程度的聚集，如果沉??淀劑體積過高會造成酶的活性喪失，如果沉淀劑體積太低，酶沉淀將不充分，導致酶活??回收率較低，因此，在沉淀劑與漆酶體積比為３：１時為最佳的實驗條件。??－１１－??

Ｆｉｇ．２－２?Ｅｆｆｅｃｔ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｐｒｅｃｉｐｉｔａｎｔ?ｔｏ?ｌａｃｃａｓｅ?ｒａｔｉｏ?ｏｎ?ｔｈｅ?ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ?ｐｒｏｃｅｓｓ??２．３．１．３沉淀溫度對酶活的影響??通過優(yōu)化沉淀過程中溫度的考察，結(jié)果如圖２－３所示。使用硫酸銨作為沉淀劑，沉??淀劑與漆酶比例為３：１條件下，恒溫震蕩３?ｈ，隨著溫度的增高，酶活回收率逐漸升??高，在２５°Ｃ下，酶活回收率最高為８９％，隨著溫度的升高，在２５°Ｃ以后，酶活回收率??又逐漸下降，在３０°Ｃ時，酶活回收率下降到８４％，這可能由于溫度過高，破壞了酶內(nèi)??部的結(jié)構(gòu)，酶分子間共價鍵斷裂，導致沉淀效果下降，而溫度過低時，酶的沉淀不完??全，酶活回收率較低，因此２５°Ｃ下，酶的沉淀效果最好。??１００?ｒ??９５?－??９０?－?Ｔ?丄??？?８５?－?「＂］內(nèi)?ｔ?土??賺?１??老８０?－??回?ｒＨ??Ｋ?７５?－?＾?一??鏜??７０?＿??６５?－??６０?￣——￣１￣￣——￣１￣——￣１￣——￣１￣——￣１￣——￣＇??０?１０?１５?２０?２５?３０??溫度（Ｃ）??圖２－３溫度對沉淀過程的影響??Ｆｉｇ．２－３?Ｅｆｆｅｃｔ?ｏｆ?ｔｅｍｐｅｒｔｕｒｅ?ｏｎ?ｔｈｅ?ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ?ｐｒｏｃｅｓｓ??－１２－??
【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 譚天偉;陳必強;;脂肪酶及其在化學品合成中的應(yīng)用[J];生物產(chǎn)業(yè)技術(shù);2010年04期

相關(guān)碩士學位論文 前3條

1 鄭德兵;磁性納米交聯(lián)酶聚集體的制備及其在微管式反應(yīng)器中的應(yīng)用[D];北京化工大學;2017年

2 楊曉丹;一色齒毛菌（cerrena unicolor）漆酶的固定化及在環(huán)境污染物降解中的應(yīng)用研究[D];福州大學;2016年

3 崔立立;磁性雜體交聯(lián)酶聚集體的制備及酶學特性的研究[D];河北科技大學;2014年

本文編號：2869157