大田軟海綿酸(Okadaic Acid,OA)及其衍生物鰭藻毒素(Dinophysistoxins,DTXs)是腹瀉性貝毒(Diarrhetic shellfish poisons,DSP)中分布最廣、危害最大的一類組分。研究顯示,OA類毒素除急性毒性(腹瀉、嘔吐等)外,還存在多種慢性毒性作用。本文在OA類毒素在致毒機(jī)制、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞毒性、遺傳毒性、神經(jīng)毒性、免疫毒性等方面進(jìn)行了綜述,為OA類毒素的進(jìn)一步毒理學(xué)研究提供了參考。本文對本實(shí)驗(yàn)前期所建立的OA類毒素的提取方法進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果顯示,色譜圖目標(biāo)峰對稱尖銳,附近無雜峰;OA類毒素在0.5-20 ng/mL內(nèi)線性良好,相關(guān)系數(shù)均大于0.999,該方法回收率高,精密度和靈敏度均滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)樣品中OA類毒素的檢測需求。以厚殼貽貝為研究對象,基于前期建立的免疫親和前處理凈化手段和液質(zhì)聯(lián)用檢測法,通過室內(nèi)模擬暴露實(shí)驗(yàn),研究了不同暴露時間下OA類毒素在貽貝及其組織中的蓄積和消除規(guī)律:(1)短期室內(nèi)模擬暴露實(shí)驗(yàn)下,設(shè)置單只貽貝P.lima的日飼喂水平為5×10~4cell,P.lima僅產(chǎn)生OA和DTX-1,其單細(xì)胞毒力分別為2.62±0.01、2.31±0.01 pg;貽貝體內(nèi)只含有OA和DTX-1,貽貝對P.lima的濾食率由99.1%逐漸下降至96.1%;貽貝對OA和DTX-1的轉(zhuǎn)化率分別為48.3-59.3%和48.5-61.4%;OA類毒素蓄積的靶器官是消化腺,各組織對OA類毒素蓄積能力的強(qiáng)弱關(guān)系為消化腺鰓肌肉外套膜咬合肌,毒素消除能力的強(qiáng)弱關(guān)系為鰓消化腺外套膜咬合肌肌肉;在當(dāng)前投喂水平下,僅需10天貽貝體內(nèi)毒素含量將高于45 OA eq./g。貽貝對OA類毒素的平均蓄積和消除速率分別為5.0和1.8 ng OA eq./g/day,貽貝對OA和DTX-1的半衰期均為4.2天。(2)長期室內(nèi)模擬暴露實(shí)驗(yàn)下,設(shè)置單只貽貝P.lima的日飼喂水平為5×10~5cell,P.lima僅產(chǎn)生OA和DTX-1,其單細(xì)胞毒力分別為3.94±0.01和3.44±0.01 pg;貽貝體內(nèi)含有OA、DTX-1和DTX-3,DTX-3所占比例為3.3-17.9%,OA和DTX-1是毒素存在的主要形式;貽貝對P.lima的濾食率由99.4%降低至58.5%;貽貝對OA和DTX-1的轉(zhuǎn)化率分別為59.0-89.9%和49.9-94.9%;OA類毒素蓄積的靶器官是消化腺,各組織對OA類毒素蓄積能力的強(qiáng)弱關(guān)系為消化腺鰓肌肉外套膜咬合肌,毒素消除能力的強(qiáng)弱關(guān)系為鰓咬合肌肌肉消化腺外套膜;蓄積第3天,OA類毒素的含量即已超過安全限量值160 ng OA eq./g,蓄積第7天時,其含量達(dá)到324.5 ng OA eq./g,兩倍于現(xiàn)行安全限量;貽貝對OA和DTX-1的半衰期分別為27.1和20.3天。若以歐盟所建議的45 ng OA eq./g為DSTs的安全限量,則推算需要42.8天才能使貽貝體內(nèi)OA類毒素含量低于這一值。(3)對比短期和長期室內(nèi)模擬暴露實(shí)驗(yàn),可以發(fā)現(xiàn):P.lima均只產(chǎn)生OA和DTX-1,然而,其產(chǎn)毒水平并非持續(xù)不變;P.lima飼喂水平和飼喂天數(shù)不僅影響貽貝的濾食率,還對貽貝對OA和DTX-1的轉(zhuǎn)化率產(chǎn)生影響;消化腺始終保持最快的毒素蓄積速率和最大的毒素蓄積量;貽貝各組織對毒素的蓄積能力相同,但對毒素的消除能力產(chǎn)生差異;單只貽貝的日飼喂水平為5×10~4cell不足以使貽貝超過安全限量,而若將飼喂水平升至原來的10倍,僅需3天,貽貝體內(nèi)毒素含量就已經(jīng)超過安全限量。
【學(xué)位單位】：浙江海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：X55;S944
【部分圖文】：

圖 1-1 OA 類毒素化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1-1 Chemical structures of OA related toxins.1 中毒事件因食用 OA 類毒素污染的貝類產(chǎn)品，引發(fā)了 2006 年英國倫敦 159 人、201建福鼎 48 人中毒事件、2011 年浙江寧波和福建寧德 200 人等中毒事件[24]，者中毒后出現(xiàn)腹瀉（92%）、惡心（80%）、嘔吐（79%）、腹痛（53%）（10%）等癥狀[25]。OA 類毒素屬于非致死性毒素，患者在治療 2-3 天后即復(fù)。.2 作用機(jī)理蛋白質(zhì)磷酸化是由蛋白質(zhì)激酶催化的把 ATP 磷酸基轉(zhuǎn)移到底物蛋白質(zhì)氨基基上的過程，主要通過絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶（protein phosphatases，PPsP1、2A、3、4、5）、酪氨酸 PPs 及雙功能 PPs（TMDP、VHR、DUSP2調(diào)控完成[26-28]。研究顯示，OA 類毒素可作為 PP1、PP2A 和 PP5 的烈性抑

15圖 2-2 陽性貽貝樣品（A）和加標(biāo)水平為 5.0 ng/g 貽貝樣品（B）MRMg.2-2 MRM chromatograms of positive mussel sample（A）and musssel spiked a（B）圖 2-2 可知，OA 和 DTX-1 在陽性貽貝樣品和加標(biāo)貽貝樣品中的出致；陽性貽貝樣品中無 DTX-2 出峰，說明陽性樣品中不含有 DTX

圖 3-1 P. lima 生長曲線及平臺期產(chǎn)毒能力Fig.3-1 Growth curve of P. lima and its toxin level in plateau period3.4.2 貽貝對 OA 類毒素的蓄積、消除室內(nèi)模擬暴露實(shí)驗(yàn)期間，實(shí)驗(yàn)組和空白組貽貝均生長狀態(tài)良好，無死亡現(xiàn)象。觀察各實(shí)驗(yàn)組貽貝的濾食情況，僅在海水中觀察到微量 P.lima 的存在，貽貝對P.lima 的濾食率在 3 天內(nèi)自 99.1%逐漸下降為 96.1%。液質(zhì)聯(lián)用檢測顯示貽貝體內(nèi)毒素組成與有毒餌料藻一致，只含有 OA 和 DTX-1 兩種毒素。文獻(xiàn)報道，OA類毒素在海洋貝類中的存在形態(tài)包括游離態(tài)和酯化態(tài)，貽貝的毒素酯化率遠(yuǎn)低于其他貝類[84]。本實(shí)驗(yàn)通過在堿性條件下水解釋放出酯化態(tài) OA 類毒素，對其總量進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)酯化態(tài)毒素所占比例為 5.2-12.2%，自由態(tài)是主要的毒素形式。貽貝對 OA 和 DTX-1 的轉(zhuǎn)化率分別為 48.3-59.3%和 48.5-61.4%。蓄積期內(nèi) OA 類毒素在各組織的分布比例如圖 3-2 所示。消化腺是 OA 類毒素蓄積的靶組織，高達(dá) 59.0-69.6%的毒素集中在該組織；隨著蓄積天數(shù)的增加，鰓中的毒力水平明顯上升，是僅次于消化腺的毒素蓄積組織（22.5-26.6%）；肌
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