由于β-內(nèi)酰胺類抗生素在醫(yī)療、農(nóng)業(yè)及畜牧業(yè)等領(lǐng)域的廣泛使用,其環(huán)境殘留對(duì)生態(tài)安全產(chǎn)生了嚴(yán)重威脅。目前,傳統(tǒng)的污水處理技術(shù)難以完全、高效、經(jīng)濟(jì)地處理該類抗生素在水體中的殘留,因此,本文將β-內(nèi)酰胺酶負(fù)載于磁性納米粒表面,用于高效特異性降解廢水中的青霉素G,并對(duì)影響該過(guò)程的因素進(jìn)行了研究,為其進(jìn)一步應(yīng)用奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。主要工作包括:設(shè)計(jì)并優(yōu)化了共價(jià)固定酶過(guò)程,并對(duì)固定酶與游離酶的酶學(xué)性能進(jìn)行了比較研究,發(fā)現(xiàn)固定化酶對(duì)反應(yīng)環(huán)境的敏感度、熱穩(wěn)定性及儲(chǔ)存穩(wěn)定性均有一定的改善。在β-內(nèi)酰胺類抗生素代表性藥物——青霉素G水溶液中,50 mg的固定化酶磁性納米粒能在5 min內(nèi)完全降解濃度為5-50 mg/L的青霉素G水溶液100 mL,并且在重復(fù)使用35次后仍保留近95%的降解效率,說(shuō)明該固定化方法能夠使β-內(nèi)酰胺酶重復(fù)利用,降低了其在抗生素降解應(yīng)用中的經(jīng)濟(jì)成本。將交聯(lián)后的β-內(nèi)酰胺酶固定于磁性納米粒,通過(guò)與直接固定化方法的對(duì)比,發(fā)現(xiàn)交聯(lián)后固定能夠更有效地保留該酶活(90.7±3.1%),并且其穩(wěn)定性及對(duì)反應(yīng)條件的敏感度有顯著改善,該方法得到的固定化酶在室溫下儲(chǔ)存20天仍保留50%的酶活力。另外,利用發(fā)酵液作為青霉素生產(chǎn)的模擬廢液,系統(tǒng)探究了交聯(lián)后固定酶的重復(fù)使用效果。結(jié)果顯示,交聯(lián)后固定化酶磁性納米粒在使用量為0.5 mg/mL時(shí),5 min能夠完全降解5 mg/L的青霉素G發(fā)酵廢液100 mL,并且在重復(fù)使用40次后依然維持98%的降解效率。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,使用交聯(lián)后固定化法制備的負(fù)載β-內(nèi)酰胺酶磁性納米�？梢宰鳛橐环N經(jīng)濟(jì)、高效、操作簡(jiǎn)便的方法,在工業(yè)廢水中β-內(nèi)酰胺類抗生素殘留的降解應(yīng)用中具有良好的前景。
【學(xué)位單位】：天津大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：X703;TB383.1
【部分圖文】：

天津大學(xué)碩士學(xué)位論文白質(zhì)。其蛋白三維結(jié)構(gòu)如圖 1-1 所示，蛋白結(jié)構(gòu)主要分為兩個(gè)區(qū)域，包括 8 螺旋組成的全 α 區(qū)域，以及 3 個(gè) α 螺旋和 5 個(gè) β 折疊組成的 α/β 區(qū)域。其中于 164 位的天冬氨酸殘基與位于 179 位的精氨酸殘基形成了一個(gè)鹽橋以維性識(shí)別中心Ω環(huán)的穩(wěn)定，并且蛋白僅含一對(duì)二硫鍵維持構(gòu)象的穩(wěn)定(77位與1的半胱氨酸殘基)。

圖 1-2 TEM 型 β-內(nèi)酰胺酶的活性位點(diǎn)示意圖[35]Figure 1-2 Schematic of active site of TEM β-lactamase1.3 酶固定化概述固定化酶指的是利用物理或者化學(xué)的方法，將蛋白酶限制于一定的空間內(nèi)并保留其催化活性。該方法能夠使蛋白酶便于從反應(yīng)體系中分離，從而控制酶促反應(yīng)進(jìn)程。與游離酶相比較，固定化酶對(duì)于操作條件的敏感度較低，一般表現(xiàn)出較高的熱穩(wěn)定性與儲(chǔ)存穩(wěn)定性，并且能夠從反應(yīng)體系中分離回收、重復(fù)利用，極大的降低了酶促反應(yīng)的經(jīng)濟(jì)成本。總的來(lái)說(shuō)，固定化酶技術(shù)提高了催化酶的生產(chǎn)力，改善了蛋白酶的催化效果，使得酶催化技術(shù)能夠應(yīng)用于更廣泛的領(lǐng)域。1.3.1 固定化酶方法

圖 1-3 固定化酶方法：(A)物理吸附法，(B)包埋法；(C)共價(jià)固定與交聯(lián)法[36]Figure 1-3 Enzymatic immobilization methods：(A) physical adsorption, (B) entrapment, (C)covalent attachment and crosslinking1.3.1.1 物理吸附法蛋白酶可以通過(guò)物理作用(如疏水作用、范德華力、氫鍵及靜電作用等)可逆地固定于載體表面的方法稱之為物理吸附法。其具有操作簡(jiǎn)單、成本低、酶活保留率較高等優(yōu)勢(shì)。該方法得到的固定化酶與載體的結(jié)合力較弱，可以在溫和的條件下從載體上可逆移除，從而使載體再生，有效降低載體的使用成本。Atacan[37]等人通過(guò)靜電作用將胰蛋白酶吸附固定于磁性納米粒表面，該固定化酶具有較高的酶活保留率 (92%)，并且相比于游離酶表現(xiàn)出良好的儲(chǔ)存穩(wěn)定性。然而，物理吸附過(guò)程通常需要將載體浸入酶溶液中孵育一段時(shí)間，或者將酶溶液置于載體表面晾干，然后沖洗掉未被吸附的酶。由于物理作用的結(jié)合能力較弱，在固定化酶
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